拮抗放线菌FX-H-51的筛选及其活性物质的研究

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本研究从土壤中分离、筛选出对多种植物病原真菌具有良好拮抗作用的放线菌,最终获得一株对禾谷丝核菌具有高效抑制活性的拮抗放线菌FX-H-51菌株。对该菌株进行鉴定,液态发酵条件优化,并以不同的分离纯化方法纯化抑菌活性物质。主要研究结果如下:1、放线菌的分离对采自山西、陕西、甘肃黄土高原地区的苹果根际土壤20余份、山东麦田根际土壤30余份样品,室内进行自然干燥等预处理后,采用平板稀释法,高氏1号培养基中加80 mg/L的重铬酸钾进行放线菌的选择性分离,共分离得到217株放线菌。2、高抑菌活性菌株的筛选以禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)、平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)为靶标菌,采用平板对峙法、灰色关联度分析法进行拮抗菌的筛选,利用平板对峙法筛选出抑菌效果较好的4株放线菌FX-H-51、FX-H-71、FX-S-114、FX-S-178;利用灰色关联度分析法对这4株菌株的生防效果及耐受性状进行综合评价,证明放线菌菌株FX-H-51综合评价指标最好,不仅对病原真菌的有较好的抑制作用,而且对不利的生长环境有良好的耐受性。3、放线菌分类地位鉴定对FX-H-51菌株进行形态和培养特征观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定其分类地位。其形态特征、培养特征均与链霉菌属一致;16SrDNA全序列共有1447 bp,与Gen Bank数据库中相关序列比对,FX-H-51菌株与海棠链霉菌(Streptomyces spectabilis)的同源性为99%,系统发育树中亲缘关系最近。由于FX-H-51菌株的生理生化特征与海棠链霉菌(Streptomyces spectabilis)存在一定的差异,初步鉴定FX-H-51菌株为海棠链霉菌的变种。4、发酵条件的优化利用单因子试验和正交试验相结合的手段,对FX-H-51菌株发酵条件进行优化。结果表明,在液体培养基主要成分为麦芽糖50.3 g、胰蛋白胨9.6 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2.0 g、蒸馏水1000 ml时,最优发酵培养条件是100 ml装液量、200r/min、pH 8.0、28℃培养7 d。5、发酵产物稳定性测定为了了解FX-H-51菌株产生抑菌活性物质的理化性质,对其发酵产物进行稳定性试验。结果表明,抑菌活性物质在室温和低温时热稳定性良好;在pH值3.011.0的条件下性质比较稳定;在紫外线处理45 min后仍具有较高的抑菌活性。6、发酵液粗提物的制备与抑菌效果采用溶媒萃取法对FX-H-51菌株产生的抑菌活性物质进行初步分离。以乙酸乙酯作为萃取剂,萃取效果最好,获得棕黄色粘稠状粗提物,以禾谷丝核菌为靶标菌,其抑菌率达到58.8%。7、发酵粗提物的分离、纯化采用薄层层析和硅胶柱层析方法对发酵粗提物进行纯化,碘熏蒸法检测证明其纯度较好。纯化产物对禾谷丝核菌菌丝生长具有很强的抑制作用,抑制效果达76.47%。
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