肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一,特别是我国,肝癌发病率高,严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌发病隐匿,早期没有明显的症状。在临床上确诊的肝癌患者中,大多已经属于中晚期。常用的肝癌诊断方法包括影像学检查、肝病灶穿刺活检以及测定血清甲胎蛋白(AFP)值。影像学检查作为临床上肝癌诊断的最常用手段却存在难以检测出小肝癌的缺陷。受肝癌病灶的大小以及部位的深浅等因素影响,肝病灶穿刺活检存在一定程度的假阴性率。当前诊断肝癌常用的指标血清AFP虽然具有很大的优势,但其灵敏度和特异性都比较低。因此,灵敏度高和特异性强的肿瘤标志物对于肝癌诊断非常重要。研究发现,外泌体LGALS3BP蛋白可以作为诊断肝癌的标志物。本实验构建了一个基于表面增强拉曼散射(SERS)技术的捕获检测系统,此系统能够直接检测血清中的外泌体LGALS3BP。在此检测系统中,免疫磁珠(IMB)通过和外泌体标志蛋白CD63结合从而将外泌体捕获,进而在磁场作用下将其分离。此外,修饰anti-LGALS3BP抗体的金纳米笼拉曼探针(AuNCs-4MBA-anti-LGALS3BP)可以结合肝癌标志物外泌体LGALS3BP,从而构成免疫磁珠、外泌体、金纳米笼拉曼探针的复合物。该复合物能够产生SERS,可以根据SERS强度定量外泌体LGALS3BP。本课题主要进行了以下研究。1.构建了 IMB捕获分离、AuNCs-4MBA-anti-LGALS3BP检测的捕获检测系统。制备并表征了构成捕获检测系统的IMB和AuNCs-4MBA-anti-LGALS3BP。结果表明,磁珠(MBs)和金纳米笼(AuNCs)的粒径均匀,形貌规整,AuNCs呈现中空介孔结构。修饰有拉曼分子4-巯基苯甲酸(4MBA)的金纳米笼(AuNCs-4MBA)表现出强烈的SERS活性。2.从细胞培养上清液提取了肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702分泌的外泌体,并用构建的捕获检测系统对其进行了检测,考察了该捕获检测系统检测肝癌细胞HepG2外泌体(HepG2-exos)的灵敏度和特异性。实验结果表明HepG2-exos浓度在5×103-5×106个/mL之间,SERS强度和HepG2-exos浓度的对数值呈现良好的线性关系。此外,相较于检测正常肝细胞HL-7702外泌体(HL-7702-exos)时产生的较弱的SERS值,捕获检测系统在检测相同浓度的HepG2-exos时产生了明显更高的SERS值,表明了此捕获检测系统检测肝癌细胞源外泌体具有较强的特异性。3.检测了人血清样本中的外泌体LGALS3BP。利用捕获检测系统分别测定了健康对照组和肝癌患者组的血清样本,评估了利用外泌体LGALS3BP作为肝癌标志物的诊断效能。结果表明,两组测定数据在统计学上具有显著性差异,根据测定结果绘制的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积为0.94,表明外泌体LGALS3BP作为标志物诊断肝癌具有较高的准确性。本课题设计的实验方法在利用肝癌标志物LGALS3BP诊断肝癌时仅需血清样本20μL,且在2 h左右就可以得出测定结果,在肝癌高灵敏、方便快捷的诊断方面具有很大潜能。