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目的:体外研究不同浓度的富血小板血浆对炎症牙周膜干细胞成骨能力的影响,并与正常状态下的牙周膜干细胞相比较。探讨富血小板血浆是否能够促进炎症状态下的牙周膜干细胞的生物学特性的改善。
方法:体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞(iPDLSCs)和正常的人的牙周膜干细胞(PDLSCs),流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定,将体外培养的iPDLSCs和PDLSCs分别分为对照组(不含PRP组)和不同浓度的PRP组(0.5%、1%、5%),并进行矿化诱导,RT-PCR检测成骨相关基因的表达,筛选出最佳PRP浓度组,并依此浓度的PRP刺激iPDLSCs和PDLSCs,并进行矿化诱导。茜素红染色观察矿化结节形成,碱性磷酸酶染色观察各组之间的颜色变化,实时定量聚合酶链反应(PCR)检测成骨相关基因的表达,western-blot检测相关蛋白的表达。
结果:(1)用体外酶消化组织块法培养的iPDLSCs和PDLSCs经流式细胞仪检测表型分子CD90、CD46、CD105、STRO-1为阳性表达,CD30、CD45为阴性表达。证明分离的细胞具有干细胞的特点。
2) iPDLSCs加入不同浓度的PRP(0%、0.5%、1%、5%)经成骨诱导一周,RT-PCR结果显示在1%PRP+iPDLSCs浓度组OCN(骨钙素)、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白(type-Ⅰcollagen,Col-Ⅰ)的mRNA表达均高于对照组(0%PRP),差异有统计学意义(p<0.05)。
(3) PDLSCs加入不同浓度的PRP(0%、0.5%、1%、5%)经成骨诱导一周,RT-PCR结果显示在1%PRP+PDLSCs浓度组上OCN、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达均高于对照组(0%PRP),差异有统计学意义(p<0.05)。
(4) PDLSCs组(0%PRP、1%PRP)和iPDLSCs组(0%PRP、1%PRP)成骨能力和蛋白表达的比较:
1)ALP染色:正常组和炎症组细胞成骨诱导一周后,ALP染色观察:1%PRP+PDLSCs组细胞颜色最深,PDLSCs和1%PRP+iPDLSCs组细胞染色次之,iPDLSCs组细胞颜色最浅。说明炎症细胞和正常细胞之间ALP活性有差异,同种细胞不同PRP浓度之间ALP活性也有差异,以1%PRP+PDLSCs组ALP活性最高。
2)茜素红染色:正常组和炎症组细胞矿化诱导21天,茜素红染色,倒置显微镜观察,各组均可见红色钙化结节,其中1%PRP+PDLSCs组矿化结节大而且多,PDLSCs组和1%PRP+iPDLSCs组矿化结节较多,iPDLSCs组矿化结节最少。说明炎症细胞和正常细胞之间成骨能力有差异,同种细胞不同PRP浓度之间成骨能力也有差异。以1%PRP+PDLSCs成骨能力最优。
3) Real time PCR和western-blot检测:正常组细胞和炎症组细胞同时成骨诱导7天后,RT-PCR检测成骨相关基因OCN、runx-2、col-1 mRNA水平的改变,结果显示1%PRP+PDLSC组成骨相关基因表达量最高,与各组相比较差异有统计学意义(p<0.05)。1%PRP+iPDLSC组成骨基因的表达的量高于iPDLSCs组,但低于PDLSCs组,差异有统计学意义(p<0.05)。western-blot检测runx-2、OCN的蛋白水平,结果显示1%PRP+PDLSC组蛋白表达量最高,1%PRP+iPDLSC组蛋白表达量高于与iPDLSCs组。
结论
1.本实验分离的PDLSCs和iPDLSCs具有自我更新能力以及多向分化能力。
2.富血小板血浆具有诱导牙周膜干细胞成骨的能力,无论是正常牙周膜干细胞还是炎症牙周膜干细胞,以1%的PRP浓度诱导成骨效率最优。
3.1)正常牙周膜干细胞的生物学特性优于炎症牙周膜干细胞的生物学特性。
2) PRP能够促进炎症牙周膜干细胞生物学特性的改善,但改善后的炎症牙周膜干细胞在生物学特性上仍旧不及正常的牙周膜干细胞的水平。