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研究背景自1982年,Moorhead等首次提出“脂质肾毒性”假说,脂质与肾脏损伤的关系逐渐得到重视。一方面,脂质异常是导致肾脏损伤的关键环节。另一方面,脂质异常可加重慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)的进展。目前由于糖尿病(diabetes mellitus,DM)、肥胖等代谢性疾病的患病率快速增加,脂质代谢异常与肾脏损伤之间的恶性循环不可小觑。探索由脂质诱导的肾脏损害的具体机制可为脂质相关肾病的防治提供新方向。传统认为类似于动脉粥样硬化,高血脂主要通过诱导肾血管内皮粥样斑块形成引起肾损伤,但脂质对肾脏的影响远不止于此。如在局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者的病理切片中可发现足细胞内脂质沉积、脂滴形成及细胞泡沫样化。脂质稳态受损可造成脂质在足细胞内过度积聚,诱发足细胞损伤,促进肾小球硬化的发生发展。清道夫受体A(scavengerreceptorA，SR-A)是细胞表面识别和摄取氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow-density lipoprotein,ox-LDL)的重要受体。在高脂条件刺激下,SR-A表达持续增加致脂质在细胞内无限积聚,是介导脂质肾脏损伤的关键分子,然而SR-A逃逸细胞内胆固醇负反馈调节的机制尚不明确。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)是迄今发现的首个具有双特异磷酸酶活性的抑癌因子,参与肿瘤发生、能量代谢等过程。我们既往体外研究表明在ox-LDL刺激下,敲除PTEN可使SR-A表达上调,细胞内胆固醇含量增加,足细胞损伤加重;相反,过表达PTEN可显示相反的效果。但PTEN调节SR-A表达的机制尚不明确。综上述,本研究拟进一步在体内观察足细胞特异性敲进PTEN在高脂饮食(high fat diet，HFD)条件下对小鼠肾脏的作用,并初步探讨足细胞内PTEN调控SR-A介导脂质摄取的具体机制。研究方法(一)体内实验:构建足细胞特异性PTEN敲进(podocyte-specific PTEN knock-in,PPKI)转基因小鼠，HFD诱导转基因小鼠肾损伤。分为正常饮食(normal diet,ND)+ 对照(Ctrl)组、ND + PPKI 组、HFD + Ctrl 组、HFD + PPKI 组。于饮食干预后第24周,免疫荧光法观察足细胞内PTEN、SR-A的表达情况;检测4组小鼠临床生化指标,包括体重、肾脏指数、血糖、血脂、血肌酐、尿白蛋白排泄(尿白蛋白与肌酐比);油红O染色和肾皮质胆固醇定量观察肾脂质积聚情况;PAS染色观察肾小球系膜基质增生情况,电镜观察肾小球足突融合、基底膜厚度,蛋白印迹检测肾组织中纤连蛋白(fibronectin，FN)、胶原蛋白Ⅳ(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达,以评估肾小球硬化情况。(二)体外实验:以ox-LDL刺激的足细胞作脂质肾损伤模型。本研究将分化成熟的足细胞分为:1)正常对照组(control组);2)ox-LDL组;3)si-YAP +ox-LDL 组;4)ad-PTEN + ox-LDL 组;5)si-PTEN + ox-LDL 组;6)Bpv + ox-LDL组。免疫荧光和蛋白印迹检测PTEN、SR-A及Hippo-YAP信号通路的活性和表达。免疫共沉淀观察PTEN与YAP之间的相互作用。结果(一)体内实验:与ND +Ctrl组相比,HFD +Ctrl组小鼠的体重、肾脏指数、血脂、血肌酐、尿白蛋白排泄水平上升,足细胞SR-A表达及肾内脂质含量明显增加,肾小球明显纤维化硬化(均P<0.05);相反,与HFD +Ctrl组相比,HFD + PPKI组小鼠肾脏指数、血肌酐、尿白蛋白排泄水平降低,足细胞SR-A表达及肾内脂质含量明显减少,系膜基质增生、足突融合及基底膜增厚程度减轻,肾组织纤维化蛋白表达下降(均P<0.05)。(二)体外实验:1)ox-LDL刺激能上调足细胞SR-A表达,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);敲除YAP可使ox-LDL诱导的SR-A表达下调(P<0.05)。2)在ox-LDL刺激下足细胞内P-YAP水平增高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);上调PTEN的表达可抑制ox-LDL诱导的P-YAP水平上调(P<0.05);而ox-LDL刺激下敲除PTEN或抑制PTEN磷酸酶活性均能进一步上调P-YAP的水平(均P<0.05);但总YAP及Hippo-YAP通路的其他分子均无明显改变。结论高脂饮食条件下足细胞特异性过表达PTEN对肾脏有保护作用,且PTEN可能通过使P-YAP去磷酸化进而抑制SR-A介导的脂质摄取从而拮抗脂质肾损伤。