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背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是起源于大肠且在大多数情况下都表现为腺癌的一种具有腺体特征的恶性上皮肿瘤。大多数结直肠癌的发生是散发性的,与遗传易感性或家族史无关;然而20-30%的结直肠癌患者具有结肠直肠癌家族史且其中的5%符合肿瘤发生符合孟德尔遗传综合征。在中国以及全世界范围内,CRC的发病率和死亡率一直呈上升趋势,严重的威胁着人们的健康。造成这一现象的部分原因是缺乏用于CRC早期预防预测、诊断和预后的可靠生物标记物。随着基因组学和生物信息学的发展,多种生物数据库逐渐被建立发展和完善,我们可以通过数据库筛选出CRC新的候选基因,通过体外功能实验以及分子机制的研究有助于我们认识CRC的发病机制,从而可以提出新的CRC预防、早期发现和治疗策略,希望能够降低CRC的发病率和死亡率。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNAs)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。越来越多的证据表明lncRNA在肿瘤发生和癌转移过程中起重要的作用,其可以作为内源性竞争RNA(ce RNAs),通过负向调控作用吸附相应的miRNAs以减轻miRNAs对下游靶基因的抑制作用,在人类疾病的调控中发挥重要作用,是CRC等多种癌症潜在的预后标志物。研究方法:1、首先通过数据库查询miR-106b-5p在CRC正常样本和癌症样本之间的表达是否存在差异,并进一步查询其与CRC的T、N、M分期之间的关系。分别在SW480、HCT116细胞中过表达和抑制miR-106b-5p的表达,通过q-PCR验证其过表达和抑制效率。接着通过cck8、克隆形成、transwell迁移和侵袭以及凋亡实验确定miR-106b-5p对SW480和HCT116细胞生物学行为的影响,以确定miR-106b-5p在CRC中发挥的作用。2、通过DIANA、miRTar Base、Target Scan、miRDB和TCGA等生物学数据库数据库预测出与miR-106b-5p表达负相关的lncRNA(NR2F2-AS1)和m RNA(PLEKHO2);在SW480细胞中过表达miR-106b-5p后通过q-PCR验证miR-106b-5p与NR2F2-AS1和PLEKHO2之间是否存在抑制作用。接着进行pearson相关系数分析得出NR2F2-AS1和PLEKHO2之间是否具有关联性。3、通过数据库预测miR-106b-5p与NR2F2-AS1 nc RNA上的结合序列,合成miR-106b-5p与NR2F2-AS1 nc RNA序列结合的野生型基因片段,构建NR2F2-AS1双荧光素酶报告基因野生型载体(wt-NR2F2-AS1)和突变型载体(mut-NR2F2-AS1),通过双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-106b-5p与NR2F2-AS1之间的调控作用;接着在HCT116细胞转染NR2F2-AS1的si RNA,选取敲低效率显著且稳定的si RNA,转染后验证NR2F2-AS1对HCT116细胞增殖和迁移的影响,并在蛋白水平验证敲低NR2F2-AS1对PLEKHO2蛋白的表达是否具有抑制作用。4、通过数据库预测miR-106b-5p与PLEKHO2 3’UTR区结合序列,合成miR-106b-5p与PLEKHO2 3’UTR区结合的野生型基因片段,构建PLEKHO2 3’UTR双荧光素酶报告基因野生型载体(wt-PLEKHO2)和突变型载体(mut-PLEKHO2),通过双荧光素酶报告基因检测系统检测miR-106b-5p与PLEKHO2之间的调控作用;接着在HCT116细胞转染PLEKHO2的si RNA,选取敲低效率最显著且稳定的si RNA,转染后验证PLEKHO2对HCT116细胞增殖和迁移的影响,并在蛋白水平验证PLEKHO2的敲低效率。5、最后通过回复实验验证PLEKHO2在RNA和蛋白水平表达的变化,接着通过回复实验验证HCT116细胞生物行为的变化,以充分证实NR2F2-AS1、miR-106b-5p与PLEKHO2之间的关系。结果:1、miR-106b-5p在结肠和直肠的癌症组织中表达显著升高,且与直肠癌的T、N、M分期相关。在SW480细胞中过表达miR-106b-5p,过表达效率高达200多倍,且过表达miR-106b-5p促进SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制其细胞的凋亡作用;抑制miR-106b-5p的表达,抑制HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进其细胞的凋亡作用。2、通过数据库预测得到与miR-106b-5p表达具有负向调控作用的lncRNA为NR2F2-AS1,m RNA为PLEKHO2;q-PCR实验结果表明在SW480细胞中过表达miR-106b-5p后NR2F2-AS1和PLEKHO2的表达被显著抑制;通过pearson相关系数分析结果表明NR2F2-AS1和PLEKHO2的表达具有正相关性。3、双荧光素酶报告基因检测系统结果进一步说明miR-106b-5p可以直接吸附NR2F2-AS1;在HCT116细胞转染NR2F2-AS1的si RNA后,NR2F2-AS1基因在RNA水平的表达显著降低;PLEKHO2的蛋白水平的表达也呈显著下降趋势,说明NR2F2-AS1和PLEKHO2之间具有正向调控的作用;功能实验结果表明敲低NR2F2-AS1促进HCT116细胞的迁移侵袭能力,但是对增殖和凋亡的影响不显著。4、双荧光素酶报告基因检测系统结果证实PLEKHO2是miR-106b-5p的靶向基因;转染PLEKHO2的si RNA后,PLEKHO2在RNA水平和蛋白水平的表达均降低;并且敲低PLEKHO2会促进HCT116细胞的迁移侵袭能力,但是对增殖和凋亡的影响同样不显著。5、回复实验q-PCR结果表明,NR2F2-AS1、PLEKHO2的si RNA对PLEKHO2基因的表达有显著敲低作用,miR-106b inhibitor对PLEKHO2的表达具有促进作用;但是在miR-106b inhibitor的基础上加入NR2F2-AS1、PLEKHO2的si RNA又会抑制PLEKHO2的表达,蛋白结果与q-PCR结果一致;功能实验结果表明,敲低NR2F2-AS1、PLEKHO2基因的表达后促进HCT116细胞的迁移和侵袭能力,inhibitor miR-106b-5p抑制HCT116细胞的迁移和侵袭能力,而在转染inhibitor miR-106b-5p的同时转染NR2F2-AS1、PLEKHO2的si RNA后发现HCT116细胞的迁移和侵袭能力又在一定程度上得到了回复(也称为挽救)。结论:miR-106b-5p在结直肠癌当中具有促癌作用,促进CRC的增殖和迁移;与其相关的lncRNA NR2F2-AS1、m RNA PLEKHO2在结直肠癌中充当抑癌基因的角色,它们可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。NR2F2-AS1可以通过吸附作用结合miR-106b-5p上调PLEKHO2的表达,抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。这一结果暗示NR2F2-AS1的表达异常可能是CRC发生的早期事件,在未来,其可能是结直肠癌早期筛查的靶点基因,并且可以通过调控NR2F2-AS1的表达来调控CRC的发展进程。