LncRNA XLOC004787在胃癌中的作用与机制研究

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目的:长链非编码RNA(lncRNAsNA)已成为重要的疾病调节因子,特别是在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色,其可参与肿瘤的增殖、侵袭、凋亡以及分化等多种生命过程。但大多数lncRNAsNA功能尚不完全清楚。实验组通基因芯片技术筛选出一个全新的lncRNAsNA(XLOC004787),预测其可能在胃癌发生发展中具有调控作用。本研究以lncRNAsNA XLOC004787为研究对象,探讨其在胃癌(gastric cancer,GC)中潜在作用及机制。方法:(1)实验组应用基因芯片技术筛选出表达差异明显的XLOC004787;应用5’-RACE,3’-RCAE测序方法对XLOC004787的全长进行测序;应用qRT-PCR分析临床胃癌标本中XLOC004787的mRNA水平表达情况;qRT-PCR分析胃癌细胞株与正常胃粘膜上皮细胞GES-1中XLOC004787的mRNA水平表达情况。(2)选择SGC-7901转染XLOC004787小干扰RNA,HGC-27细胞转染过表达质粒;Transwell实验、CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验检测XLOC004787对胃癌细胞迁移和增殖功能的影响以及对EMT进程的调控作用;应用细胞免疫荧光技术分析关键核转位因子p-smad2/3和β-catenin的入核情况。(3)应用lncRNAsNA下游预测网站筛选了XLOC004787的下游靶基因,应用双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR实验、细胞共转染功能学实验验证靶向基因。结果:(1)qRT-PCR结果显示,与正常组织相比,胃癌组织中XLOC004787的表达水平相对较高(81%,26/32);与胃粘膜细胞GES-1相比较,胃癌细胞株中XLOC004787的表达升高,SGC-7901细胞的表达水平相对较高,HGC-27细胞内的表达水平相对较低。(2)Transwell小室实验、CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验的结果显示:在SGC-7901细胞中敲低XLOC004787的表达后,细胞的增殖迁移能力以及EMT进程均被抑制。Western-blot结果显示:上皮细胞标志物E-钙粘蛋白表达上升,间充质细胞标志物如N-钙粘蛋白、snail、vimentin、MMP2、MMP9表达均下降,Wnt与TGF-β信号通路中关键蛋白的表达均下降,细胞免疫荧光实验结果发现关键因子p-smad2/3、β-Catenin的核转位趋势降低。在HGC-27细胞中转染过表达质粒过表达XLOC004787后,功能实验结果显示:与对照组相比较,过表达XLOC004787后细胞的迁移增殖能力增强并且促进细胞的EMT进程。Western-blot结果显示上皮细胞标志物E-钙粘蛋白表达下降,间充质细胞标志物如N-钙粘蛋白、snail、vimentin、MMP2、MMP9表达均上升,Wnt与TGF-β信号通路中关键蛋白的表达均上升。细胞免疫荧光实验结果显示关键因子p-smad2/3、β-Catenin的核转位趋势上升。(3)网站预测XLOC004787下游靶基因为miR-203a-3p。qRT-PCR结果显示,敲低XLOC004787的表达后miR-203a-3p的表达上升,并且过表达XLOC004787后miR-203a-3p的表达下降;双荧光素酶报告基因实验结果显示:转染了XLOC004787野生型质粒与miR-203a-3p-mimics的实验组相较于其他实验组萤火虫/海肾荧光素酶的比值下降,miR-203a-3p-mimics与XLOC004787-siRNA共转染功能学实验发现,共转染组相较于XLOC004787敲减组,细胞增殖与迁移抑制现象被缓解。结论:(1)XLOC004787在胃癌组织中与胃癌细胞系中表达水平较高。(2)高表达的XLOC004787能够促进胃癌细胞的增殖迁移以及EMT进程。(3)XLOC004787在胃癌细胞中发挥促癌作用,并可能为胃癌的诊断治疗提供新的靶向分子。
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