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背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是临床上一种以肾功能在短期内迅速恶化和急性肾小管坏死为特征表现的死亡率高且预后较差的疾病。AKI可由多种原因引起,包括缺血/再灌注损伤(IRI)、脓毒血症和肾毒性药物等。肾毒性药物带来的药物相关性肾损伤已成为住院患者发生AKI的重要原因。其中,临床上广泛使用的化疗药物顺铂(cisplatin)已经被证实是一种肾毒性药物,可以在肾小管上皮细胞中积聚,引发细胞损伤和死亡。因此,深入探究药物性AKI发生的病理生理机制并找寻新的作用靶点,为临床上AKI的诊治提供明确的理论依据至关重要。TNFAIP8(TNF-α-induced protein8)家族是一类主要与细胞免疫、炎症和肿瘤相关的蛋白家族,该家族由四个成员组成,包括TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3。目前对TIPE和TIPE2的研究较为详尽,而对TIPE1和TIPE3研究较少。研究表明TIPE1广泛存在于小鼠各个组织器官中,而且在肾脏中表达较高;同时TIPE1也具有多种功能,可以调控细胞凋亡、细胞增殖、自噬和氧化应激,在肿瘤疾病中既发挥抑癌作用又具有促癌作用。目的目前关于TIPE1在急性肾损伤中的表达及作用的研究尚未发现有关报道。故本课题拟通过建立AKI动物和细胞模型,探究TIPE1在顺铂诱导的急性肾损伤中的表达及作用,为今后AKI的发病机制和临床治疗提供新的见解。方法1.TIPE1在急性肾损伤小鼠模型中的表达:将满足实验条件的12只雄性C57BL/6小鼠随机分成两组:对照组(control)和模型组(AKI)。AKI组和control组小鼠分别接受单次腹腔注射20mg/kg顺铂和等体积的生理盐水(NS),顺铂造模5天后采取一侧眼球摘除法收集小鼠血液和肾脏标本,生化试剂盒检测血清中Scr、BUN水平;通过苏木素-伊红染色法观察小鼠肾小球、肾小管等肾脏组织结构病理改变情况;免疫组化检测肾组织上TIPE1的表达;qRT-PCR法检测肾组织上TIPE1 mRNA表达水平;通过Western印迹法检测肾组织中TIPEI的表达水平。2.急性肾损伤小鼠肾组织中肾小管损伤情况和自噬变化:通过使用Western印迹法检测肾小管早期损伤标志物NGAL、自噬相关分子LC3、Beclinl和p62蛋白的表达水平。3.TIPE1在急性肾损伤细胞模型中的表达:用浓度为20 μmol/L顺铂刺激HK-2细胞0、6、12、24小时,qRT-PCR和Western blot检测不同时间点HK-2细胞上TIPE1 mRNA和蛋白表达变化;细胞免疫荧光检测HK-2细胞在顺铂处理前后TIPE1的表达。4.顺铂处理的不同时间点对HK-2细胞自噬的影响:Western blot检测HK-2细胞在0、6、12、24小时自噬相关蛋白LC3、Beclinl和p62的表达变化。5.敲除TIPE1基因对HK-2细胞自噬及肾小管损伤程度的影响:用慢病毒构建TIPE1稳定敲除HK-2细胞株,分为空载体组(Scramble siRNA)和TIPE1干扰组(TIPE1 siRNA),每组分别用20μmol/L顺铂和等体积生理盐水刺激24h。通过Western印迹法对每组HK-2细胞NGAL、LC3、Beclinl以及p62蛋白表达水平进行检测。结果1.肾组织HE染色结果显示,AKI小鼠出现肾小管上皮细胞空泡样变性和核固缩,并且坏死的上皮细胞从基底膜脱落进入小管管腔内形成细胞管型;免疫组织化学染色显示,在AKI小鼠肾组织中TIPE1主要在近端肾小管上皮细胞内表达成上升趋势;qRT-PCR和Western blot结果显示AKI小鼠肾组织上TIPE1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);Western印迹结果显示AKI小鼠肾组织上NGAL蛋白、自噬相关蛋白LC3-II、Beclinl及p62表达水平显著升高(P<0.05);这些结果提示AKI小鼠肾组织中TIPE1表达升高、自噬水平上调且存在明显的肾小管损伤。2.HK-2细胞qRT-PCR和Western blot结果显示,随顺铂刺激时间延长,TIPE1在mRNA和蛋白水平上表达逐渐升高(P<0.05),呈时间依赖性;Western blot结果显示,LC3-II和Beclinl随顺铂刺激时间增加表达升高(P<0.05),p62蛋白表达水平下降(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,与未接受过顺铂刺激的HK-2细胞相比,TIPE1在顺铂刺激HK-2细胞24h后表达显著升高(P<0.05);上述结果提示HK-2在接受顺铂刺激后TIPE1表达升高且自噬活动被激活。3.首先用慢病毒干扰HK-2细胞上TIPE1表达,再对细胞用顺铂或生理盐水进行刺激,刺激24小时后的细胞Western blot结果显示,TIPE1干扰组较空载体组相比NGAL、LC3-II、Beclin1和p62蛋白水平表达升高(P<0.05),这些结果表明TIPE1敲除后可能会诱导HK-2细胞发生过度自噬从而加重近端肾小管损伤。结论TIPE1在顺铂诱导的急性肾损伤中表达水平明显升高,体外干扰TIPE1基因表达后则引起近端肾小管上皮细胞过度自噬从而加重急性肾损伤,这可能为TIPE1参与急性肾损伤的发病机制提供了理论依据。