【摘 要】
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目的基因工程小鼠是肿瘤研究中十分有用的动物模型。本课题组在前期胃癌基础研究中关注到以下三个与胃癌发生发展密切相关基因:IRX1易洛魁家族同源盒基因,抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移;DICER1核酸内切酶Ⅲ基因,通过调控micro RNA的加工与成熟过程抑制肿瘤;FBXW7泛素连接酶基因,参与癌蛋白的泛素化降解和DNA损伤修复而发挥抑癌作用。为了探明IRX1、DICER1和FBXW7基因在胃癌发生发
【基金项目】
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科技部重大项目（2016YFC1303202,2012AA02A504,2012AA02A203）； 国家自然科学基金（81372644）； 上海交通大学医学院转化医学创新基金项目（15ZH1002,15ZH4001,TM201617）；
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目的基因工程小鼠是肿瘤研究中十分有用的动物模型。本课题组在前期胃癌基础研究中关注到以下三个与胃癌发生发展密切相关基因:IRX1易洛魁家族同源盒基因,抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移;DICER1核酸内切酶Ⅲ基因,通过调控micro RNA的加工与成熟过程抑制肿瘤;FBXW7泛素连接酶基因,参与癌蛋白的泛素化降解和DNA损伤修复而发挥抑癌作用。为了探明IRX1、DICER1和FBXW7基因在胃癌发生发展中的作用,本课题开展了如下两个方面的研究:（1）构建Irx1、Dicer1、Fbxw7基因敲除小鼠模型;（2）上述小鼠的诱癌实验及分子机制研究。方法（1）利用Irx1嵌合小鼠构建Irx1全身性基因敲除小鼠模型,观察Irx1敲除对小鼠胚胎发育和生长繁殖的影响。（2）利用Lox P-Cre系统构建Dicer1基因在Villin表达阳性胃祖细胞条件性基因敲除小鼠模型。对纯和敲除小鼠(Dicer1-/-)、杂合敲除小鼠(Dicer1+/-)和野生小鼠(Dicer1+/+)连续观察50周,记录其生长和自发病变情况;给予化学致癌剂MNU处理,连续观察35周,记录小鼠胃癌成瘤率,并进行转录组与micro RNA测序。（3）利用Fbxw7嵌合小鼠构建Fbxw7基因敲除小鼠模型。给予Fbxw7+/-和Fbxw7+/+小鼠MNU处理,连续观察35周,记录成瘤率,免疫组化比较小鼠胃癌组织细胞增殖和凋亡差异;WB检测小鼠和人胃癌样本中FBXW7及下游靶蛋白c-Myc表达;细胞免疫荧光、WB和彗星实验检测小鼠胚胎成纤维细胞MEFs(基因型为Fbxw7+/-、Fbxw7+/+)的DNA损伤修复反应差异。结果（1）Irx1小鼠基因型鉴定:Irx1-/-小鼠,Irx1产物709bp,TDP没有条带;Irx1+/-小鼠,Irx1产物709bp,TDP产物为106bp;Irx1+/+小鼠,Irx1没有条带,TDP产物106bp。Irx1+/-小鼠杂交,出生的子代中没有Irx1-/-小鼠,在E10.5天和E9.5天的胚胎中也没有检测到Irx1-/-,提示Irx1基因纯和敲除具有胚胎致死性,且胚胎死亡时间早于E9.5天。（2）Dicer1小鼠基因型鉴定:Dicer1-/-小鼠,Dicer1产物420bp,Cre/Vil-cre产物233bp/1100bp;Dicer1+/-小鼠,Dicer1产物420bp和351bp,Cre/Vil-cre产物233bp/1100bp;Dicer1+/+小鼠,Dicer1产物420bp,Cre/Vil-cre无条带。经过50周观察,Dicer1-/-小鼠自然死亡率高于Dicer1+/-和Dicer1+/+小鼠,体重低于Dicer1+/-和Dicer1+/+小鼠。3种基因型小鼠在50周龄解剖时均未发现有自发胃癌。Dicer1-/-小鼠出现肾囊性变,结肠杯状细胞消失和腺瘤形成。Dicer1-/-小鼠肾脏、小肠和结肠有VILLIN和CRE蛋白定位,DICER1表达低于Dicer1+/+。给药组,Dicer1-/-小鼠胃癌发生率高于Dicer1+/-和Dicer1+/+小鼠,胃肿瘤局部DICER1表达降低。转录组和micro RNA测序结果显示,Dicer1-/-和Dicer1+/+小鼠存在44个差异表达micro RNA和1020个差异表达基因。（3）Fbxw7小鼠基因型鉴定:Fbxw7+/+小鼠PCR产物359bp;Fbxw7+/-小鼠PCR产物232bp和359bp。Fbxw7+/-小鼠胃癌成瘤率高于Fbxw7+/+小鼠,细胞凋亡水平更低。Fbxw7在小鼠和人的胃癌中表达都比癌旁低,靶蛋白c-Myc则相反。基因型为Fbxw7+/-的MEFs表现出明显的DNA损伤修复延迟。结论基因敲除小鼠模型是深入研究目的基因功能的重要实验手段。本研究通过基因敲除小鼠模型构建,首次明确了抑癌基因Irx1纯和敲除引起胚胎死亡;成功构建了Dicer1胃祖细胞条件性敲除小鼠模型,该小鼠在50周内没有自发胃部肿瘤,但在化学致癌剂MNU诱导下发生胃癌的比例高于野生型小鼠;Fbxw7杂合敲除小鼠在MNU诱导下胃癌发生率高于野生型小鼠,主要机制为Fbxw7基因单倍剂量不足导致的对下游靶蛋白c-Myc降解能力下降及DNA损伤修复延迟。
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