α-氟羧酸(α-fluorocarboxylic acids,FCAs)由于其固有的生物活性和作为构建更复杂药物分子的前体,受到了广泛的关注。目前合成手性α-氟取代的羧酸类化合物主要通过化学方法,然而传统的化学方法操作复杂,立体选择性差,金属催化剂的使用也容易造成环境污染等问题。近年来随着生物催化的发展,相对于化学催化,生物催化往往能在温和的条件下实现反应,具有绿色环保,催化效率高,对映选择性好等优点,因此发展生物催化的方法来制备这一类有机氟化物对于整个有机氟化学领域都是一个重要的推动。然而酶本身也具有热稳定性低,以及针对非天然底物催化效率低等特性,这些缺点严重阻碍了它们的广泛应用。而随着分子生物技术的发展,基因合成以及测序成本的降低,一系列的方法工具(基因挖掘,定向进化计算机辅助设计等等)也被开发出来,有效弥补了这些缺点,全面地推动了生物催化在有机化学领域的开发和利用。前期的工作中发现氟乙酸脱卤酶RPA1163可以特异催化(S)构型的α-氟代苯乙酸以及α-氟代苯丙酸脱氟水解生成对应的(R)构型的α-羟基苯乙酸以及α-羟基苯丙酸,具有手性拆分的潜在用途。但以前的研究主要集中在研究水解脱氟机理方面,所尝试的底物谱也非常狭窄。本论文深入研究了氟乙酸脱卤酶RPA1163在手性拆分中的应用,通过对其进行半理性设计,显著提高了其针对目标底物的活性,成功实现了该酶催化的α-氟代羧酸的克级拆分。此工作不仅开拓了氟乙酸脱卤酶新的用途,为合成手性纯的α-氟代羧酸和α-羟基酸类化合物提供了新思路,而且显示了计算机辅助设计的精准性,为改造蛋白提供了一个强有力的工具。本研究主要围绕以下三个方面展开:1.首先优化了整个反应条件,发现目标蛋白RPA1163热稳定性极高,即使室温存放10天,都未见明显失活。并且在此基础上优化了反应条件,进一步拓展了其底物范围。RPA1163对大多数底物都体现了良好的生物活性。2.针对活性较低的底物,通过计算机辅助半理性设计策略,实验测试发现通过定点突变构建突变体,显著提高了针对目标底物的活性。进一步测试其他底物发现,突变体对大多数底物均有明显提高。最后通过实验以及理论计算的方法阐明了突变体针对模式底物活性提高的机理。3.测试了该酶催化α-氟代羧酸克级手性拆分的能力。通过以野生型氟乙酸脱卤酶RPA1163和突变体W185N、W185T全细胞冻干粉为生物催化剂,实现了α-氟代羧酸的克级拆分,成功制备分离获得10种光学纯的(R)-α-氟代羧酸和10种光学纯的(R)-α-羟基羧酸。