论文部分内容阅读
露地菊(Chrysanthemum morifolium)是菊科、菊属的多年生宿根草本植物。露地菊是在地被菊基础上获得的具有优良性状的新品种。露地菊具有植株低矮,管理粗放,观赏价值高,抗逆性强等特点,是北方最常见的景观植物。质膜内在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)作为水孔蛋白超家族MIP家族的一员,在植物抗逆过程中起到至关重要的作用。本试验从露地菊试验品种的抗逆性出发,根据已有的关于PIPs水孔蛋白的相关抗逆性研究及其在转基因植株抗逆过程中发挥的作用,利用相关生物信息学手段分析其他物种中已知的PIP基因序列,通过分子克隆技术获得露地菊CmPIP基因序列,进行相关的功能性研究,探寻CmPIP基因在植物抗逆过程中的表达模式。研究获得转基因露地菊再生植株,在一定程度上获得抗逆性更强的植株,为进一步研究露地菊抵抗胁迫环境,研究露地菊抗逆机理,改良露地菊抗逆特性,提高抗逆生长能力奠定基础。本研究的主要结果如下:1.以东北林业大学花卉研究所培育的露地菊‘火焰’品系作为试验材料,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得露地菊CmPIP基因信息,共获得两种序列,根据同源性比对分别命名为 CmPIP1(GenBank:KJ489416.1)和 CmPIP2(GenBank:KJ756774.1)。CmPIP1全长为 1170 bp,CmPIP2全长为918 bp,分别包含长为864 bp和858 bp的开放阅读框,能够编码287和285个氨基酸序列。利用NCBI的Blast比对发现CmP1P1与非洲菊水孔蛋白具有高达99%的相似性,CmPIP2与葡萄VvPIP2也有95%相似性。进化树分析发现CmPIP1基因与玉米PIP1-1基因在进化关系上最为相近,与拟南芥、葡萄等物种也有较高的进化同源性;CmPIP2基因与杨树PIP基因进化关系最近,与欧洲油菜也有较好的进化同源性。生物信息学分析结果发现二者均含有MIP超家族保守MIP结构域,以及水孔蛋白NPA基序,可以确定二者均属于水孔蛋白。2.洋葱表皮细胞亚细胞定位试验发现CmPIPI与CmPIP2定位在质膜上。3.酵母双杂交试验验证CmPIP1与CmPIP2之间不存在相互作用关系。4.200 mmol/L的NaCl处理露地菊72 h,分别在2,4,8,12,24,48,72 h取露地菊叶片及根部用以Real-Time PCR试验,研究CmPIP基因在盐胁迫条件下的表达模式。实时荧光定量PCR结果分析发现:在露地菊叶片中,CmPIP1在整个盐处理过程中均表现-为下调表达;而CmPIP2在胁迫的前4 h内表达量显著上升,但在4 h后直到胁迫结束其表达量均下降。在露地菊根部,CmPIP2在胁迫8 h时其表达量达到峰值,并且在胁迫开始的48 h内均为上调表达。5.根据克隆获得的CnPIP1和CmPIP2基因序列,利用Gateway技术构建pH7WG2D-CmPIP表达载体和pH7GWIWG21-CmPIP干涉载体。通过三亲杂交法将表达质粒转入农杆菌LBA4404菌株中用于植物遗传转化。6.利用Gateway技术构建甘露糖异构酶基因(PMI)及羊草质膜内在蛋白基因(LcPIP)双元表达载体。利用农杆菌介导法将构建的pCAMBIA1301-PMI-LcPIP表达载体转入东北林业大学露地菊‘火焰’品系中,对阳性再生植株叶片进行PCR分子鉴定,获得与目标条带相一致的条带。GUS染色对已初步鉴定的转基因植株进行染色发现在转基因植株叶片出现蓝色斑点,表明pCAMBIA1301-PMI-LcPIP表达载体在转基因植株中已经开始表达。7.Real-Time PCR分析盐胁迫条件下转基因与野生型植株中CmPIP1与CmPIP2基因的表达模式发现在转基因植株的叶片中CmPIP1和CmPIP2基因响应盐胁迫能力均明显高于野生型植株。外源转入的LcPIP基因能够上调表达内源CmPIP基因8.通过测定转基因露地菊及野生型露地菊在盐胁迫条件下SOD、POD活性和MDA含量验证转基因植株抗盐胁迫能力:转基因露地菊具有更强的盐胁迫耐受能力。