结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率就全球而言仍然在不断上升，全世界每年以2％的速度增长，我国上海也以4.2％的速度增长，可见结直肠癌严重威胁着人类的健康。治疗上，目前仍以手术、术后辅助化疗、放疗等为主，但总的治疗效果还不令人满意。 随着分子生物学的深入研究，近年来发现肿瘤的发生、发展与细胞内的某些靶位点有很大的关系，肿瘤细胞的某些靶点分子的过度表达与肿瘤的发生发展及预后密切相关。结直肠癌的血管内皮生长因子(VEGF)，表皮生长因子受体(EGFR)，环氧化酶-2(COX-2)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的过度表达也受到广泛的关注与研究。这都为结直肠癌的靶向治疗提供了理论依据和条件。 文献报道结直肠癌细胞iNOS表达阳性率70％-85.5％，并与结直肠癌的发生发展及预后密切相关。因此，较多学者将iNOS作为结直肠癌化学预防和辅助治疗的重要分子靶标，将选择性iNOS抑制剂作为有着重要应用前景的靶向治疗药物。但目前相关的研究主要集中在iNOS及其产物NO与肿瘤血管生成上，而对选择性iNOS抑制剂与结直肠癌的细胞学实验研究报道较少。 本课题的目的是研究选择性iNOS抑制剂氨基胍(aminoguanidine，AG)对人结直肠癌细胞株LoVo增殖与凋亡的影响，并对其作用机制进行初步探讨，为选择性iNOS抑制剂作为结直肠癌的靶向治疗药物提供理论依据。 方法与结果 一、应用MTT比色法检测氨基胍对LoVo细胞增殖的抑制作用： 实验方法：将培养至80％融合的LoVo细胞接种于A、B、C3个96孔板，每板分设对照组、0.125mmol/L氨基胍组、0.250mmol/L氨基胍组、0.500mmol/L氨基胍组、1.000mmol/L氨基胍组，每组设6个复孔。细胞常规培养至指数生长期时换液，对照组继续用RPMI-1640培养，实验组改用含相应浓度氨基胍的培养液培养。分别培养24hr、48hr、72hr后加入MTT及DMSO，然后酶联仪检测570nm波长的吸光度值(OD值)，结果输入SPSS11.0forWindows软件，应用随机区组设计的方差分析(TowWayANOVA)对数据进行处理，并绘制不同浓度氨基胍作用于LoVo细胞24hr、48hr、72hr细胞生长抑制率图形。 结果： (1)0.125mmol/L氨基胍组、0.250mmol/L氨基胍组各作用时段OD值与对照组无统计学差异(p＞0.05)。0.500mmol/L氨基胍组、1.000mmol/L氨基胍组OD值与对照组差异有显著性(p＜0.05)，0.500mmol/L氨基胍组与1.000mmol/L氨基胍组之间比较也有显著性差异(p＜0.05)。 (2)各组在不同浓度氨基胍作用24小时、48小时、72小时各时段两两比较OD值具有显著性差异(p＜0.05)。 (3)绘制不同浓度氨基胍作用于LoVo细胞不同时段的抑制率图形显示，氨基胍对人结直肠癌LoVo细胞生长的抑制率呈明显的时间、浓度依赖性。0.500mmol/LAG作用24小时后，LoVo细胞的生长呈现明显的抑制状态。1.000mmol/L氨基胍作用于结直肠癌LoVo细胞72小时后抑制率可达到78％。 结论：氨基胍可抑制结直肠癌LoVo细胞的增殖，并呈一定的时间和浓度依赖性。细胞生长抑制率随药物浓度的增大和作用时间的延长而增高。 二、流式细胞术检测分析不同浓度氨基胍作用后LoVo细胞的凋亡率和细胞周期分布变化： 实验方法：结直肠癌LoVo细胞传代培养至80％融合时，传代并接种至A、B、C、D、E5个培养瓶中，分别为对照组、0.125mmol/LAG组、0.250mmol/LAG组、0.500mmol/LAG组、1.000mmol/LAG组。当各组细胞培养至指数生长期时换液，分别加入RPMI-1640培养液及含相应浓度氨基胍的培养液，继续培养48h。收集各组培养瓶中的LoVo细胞，消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度在1×106/ml，以95％冷乙醇2ml固定1hr，然后以PBS漂洗混匀细胞，加入含RNA酶A的碘化丙啶染料，避光1hr，上机进行流式细胞仪检测，细胞周期分析显示细胞周期分布和凋亡率，计算SPF、PI值。并将数据输入SPSS11.0forWindows系统，应用单因素方差分析(One-WayANOVA)进行分析。 结果： (1)随氨基胍浓度的增高，G0/G1期细胞比率增高，而S期与G2/M期细胞比率相应降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。 (2)0.125mmol/LAG组、0.250mmol/LAG组与对照组相比凋亡率差异无显著性，p＞0.05。而0.500mmol/LAG、1.000mmol/LAG作用于LoVo细胞48小时后凋亡率分别可达(25.90±1.65％)和(45.30±1.32％)，与对照组(1.29±0.36％)相比差异具有显著性(p＜0.05)。且0.500mmol/LAG组与1.000mmol/LAG组两者之间差异具有显著性，p＜0.05。 (3)0.125mmol/LAG组、0.250mmol/LAG组S期细胞比率(SPF)、增殖指数(PI)与对照组相比差异无显著性，p＞0.05。0.500mmol/LAG与1.000mmol/LAG作用于LoVo细胞48hr后细胞增殖指数分别为(8.45±0.59％)和(6.38±1.02％)，与对照组(24.20±1.82％)相比有统计学差异(p＜0.05)。两者之间差异具有显著性，p＜0.05。 结论：流式细胞术检测氨基胍作用LoVo细胞48小时后细胞周期分布显示，随着氨基胍浓度的增加，G0/G1期细胞百分数增多，S期和G2/M期细胞相应减少，SPF减少、增殖指数PI减小；而凋亡率逐渐增加。说明氨基胍可以抑制结直肠癌LoVo细胞的增殖，促进细胞凋亡，并呈剂量—浓度依赖性特点。 三、丫啶橙结合溴化乙锭染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态学改变： 实验方法：将指数生长期的结直肠癌LoVo细胞接种到A、B、C、D、E5个培养瓶中，分别为对照组、0.125mmol/LAG组、0.250mmol/LAG组、0.500mmol/LAG组、1.000mmol/LAG组；分别以RPMI-1640培养液和含相应浓度氨基胍的培养液培养。分别将培养24hr、48hr、72hr的LoVo细胞制成单细胞悬液，细胞计数调整细胞浓度在1×107/ml，取5ul细胞悬液滴于载玻片上，加10ul荧光染色液(0.01％的丫啶橙和溴化乙锭各5ul)染色1min。荧光显微镜下观察，以出现细胞体积缩小，核固缩，染色质浓集和凋亡小体形成判定为凋亡细胞。 结果与结论：0.5mmol/L氨基胍作用于LoVo细胞24hr后出现典型的凋亡细胞形态学改变：细胞体积缩小，核固缩，荧光染色增强以及凋亡小体形成。随氨基胍浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡愈明显。 全文结论： (1)氨基胍可抑制LoVo细胞的增殖，并呈一定的时间和浓度依赖性。细胞生长抑制率随药物浓度的增大和作用时间的延长而增高。 (2)随着氨基胍浓度的增加，G0/G1期细胞百分数增多，S期和G2/M期细胞相应减少，SPF减少、增殖指数PI减小；而凋亡率逐渐增加。说明氨基胍可以抑制结直肠癌LoVo细胞的增殖，促进细胞凋亡，并呈一定的剂量—浓度依赖性特点。 (3)氨基胍作用于LoVo细胞24小时后出现典型的凋亡细胞形态学改变：细胞核体积缩小，核固缩，荧光染色增强以及凋亡小体形成。随氨基胍浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡愈明显。 (4)选择性iNOS抑制剂氨基胍抑制LoVo细胞增殖，促进细胞凋亡的作用机制之一为氨基胍阻止LoVo细胞的细胞周期进展。