论文部分内容阅读
目的：研究一氧化氮(nitricoxide，NO)对豚鼠耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流(ICa-L)的影响，探讨一氧化氮(NO)对外毛细胞L-型钙通道电流(ICa-L)的作用机制，以及如何调节外毛细胞的功能状态，从而影响某些内耳疾病的发生和发展，为临床防治梅尼埃病、突发性耳聋、老年性聋、噪声性聋等内耳疾病提供理论依据和新的思路。
方法：采用急性酶分离方法分离细胞和全细胞膜片钳记录通道电流。1.细胞分离选择耳廓反射灵敏的健康花斑豚鼠(250～400g)40只，断头后取出听泡，快速将Cortis器暴露于Hanks液中，解剖显微镜下去除耳蜗骨壳，保持膜迷路完整，断轴后取出膜迷路，迅速放入含胶原酶Ⅳ的DHanks液中消化10～20分钟，再置入含钙的Hanks液中浸浴5分钟，以便终止消化。再放入预先用多聚赖氨酸处理过的浴槽中，显微镜下撕去螺旋韧带，机械分离出外毛细胞，静置10分钟贴壁后，可用于实验。2.通道电流记录取急性酶机械分离的豚鼠耳蜗外毛细胞置于细胞外液(Ca2+浓度1.8mmol/L)中，用膜片钳全细胞记录方式记录其L-型钙通道电流，所得电流通过膜片钳放大器(AXOPATCH-200B)放大，滤波(10KHz)后输入计算机，采用P-Clamp9.0分析软件进行分析处理，并选用以下分析指标：(1)电流幅值(CurrentAmplitude，Am)。(2)电流密度(Currentdensity)。(3)通道电流的电流-电压关系曲线(Ⅰ-ⅤCurve)。3.鉴别并分析通道特性通过改变指令电压(VT)，观察并记录该通道电流的电生理特性，包括通道开放的电压依赖性，电流幅值，电流密度，电流-电压曲线。并观察通道电流是否具有“Rundown”现象。观察L-型钙通道特异性阻断剂维拉帕米对通道活动的影响。4.药物作用观察(1)记录到稳定的电流后，向浴槽内加入新配制好的L-Arg(L-精氨酸)溶液。本实验中浴槽内浴液为2mi，依次向浴槽内加入1.0×10-4mol/LL-Arg溶液10.0ul，20.0ul，30.0ul，40.0ul，浴液中药物的浓度则依次达0.5×10-6mol/L，1.0×10-6mol/L，1.5×10-6mol/L，2.0×10-6mol/L，观察并记录不同浓度L-Arg对ICa-L的作用。再加入等浓度的L-NMMA(NG-甲基-L-精氨酸)，观察其对L-Arg的拮抗作用。再选用另外的细胞，同样在记录到稳定的电流后，依次向浴槽内加入1.0×10-4mol/LL-NMMA溶液10.0ul，20.0ul，30.0ul，40.0ul，观察并记录不同浓度L-NMMA对ICa-L的作用。(2)以上每次加药后均用不含药物的细胞外液灌洗，观察通道的恢复情况。
结果：1.应用膜片钳全细胞记录方法(whole-cellpatchclamptechnique)，记录到一电压依赖性的内向电流，该电流在-40mV～-30mV开始激活，当VT为0mv时电流幅值Am达峰值，反转电位(Vrev)约为+60mV，Ⅰ-Ⅴ曲线为钟型，并具有明显的“Rundown”现象。2.记录到稳定的电流后，向浴槽内加入L-Arg，通道电流在L-Arg浓度为0.5×10-6mol/L～1.5×10-6mol/L表现为浓度依赖性抑制，用药后5分钟内各组ICa-L峰值电流密度增幅最大值分别为：0.5×10-6mol/LL-Arg组从3.78±1.40pA/pF降至3.70±1.22pA/pF，增幅为-2.12％(n=5)；1.0×10-6mol/LL-Arg组从3.78±1.40pA/pF降至2.62±0.85pA/pF，增幅为-30.69％(n=5)；1.5×10-6mol/LL-Arg组从3.78±1.40pA/pF降至1.32±0.17pA/pF，增幅为-65.08％(n=5)；但以上浓度的L-Arg均不改变ICa-L的激活电位(-40mV～-30mV)，峰值电位(0mV)和反转电位(+60mV)。洗脱后通道电流部分恢复。L-Arg浓度超过2.0×10-6mol/L通道电流则表现为激活，用药后5分钟内ICa-L峰值电流密度从1.32±0.17pA/pF增至2.72±0.15pA/pF，增幅为51.47％(n=5)，洗脱后通道电流可部分恢复。再加用2.0×10-6mol/LL-NMMA后通道电流被抑制，逐渐恢复到对照水平，用药后5分钟内ICa-L峰值电流密度从2.72±0.15pA/pF降至1.35±0.12pA/pF，增幅为-50.37％(n=5)；Am和电流密度变化明显。记录到稳定的电流后，单独向浴槽内加入不同浓度L-NMMA，通道电流无明显变化。
结论：1.本实验测得的电流为钙电流，具有电压依赖性、“Rundown”现象、对L-型钙通道的特异性阻断剂敏感等特性。2.低浓度的NO供体L-Arg可以抑制单离外毛细胞L-型钙通道电流，高浓度的NO供体L-Arg则可以激活豚鼠耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流，NO供体L-Arg联合应用NOS拮抗剂L-NMMA可以逆转高浓度L-Arg对通道电流的激活作用。3.实验结果证明，在NO对耳蜗外毛细胞L-型钙通道电流影响的过程中，存在NO/ICa-L途径。4.根据实验结果推测，豚鼠耳蜗外毛细胞内存在抑制Ca2+升高的其它某种途径或负反馈调节机制。