来自微藻的生物柴油是第三代生物能源,由于其相实用性更广,碳中性和可持续性,而受到了广泛的关注。作为微藻家族中重要的一员,杜氏盐藻（Dunaliella salina）是最早进行商业化生产的微藻,它不仅含有丰富的油脂,还能在恶劣环境中顽强生长,并可以有效地通过大规模开放式培养获得大量藻体,极大地降低培养成本,是非常适合作为高油脂工程藻株的候选藻种。而作为杜氏盐藻甘油合成途径中的主要限速酶,甘油-3-磷酸脱氢酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH）与生产生物柴油的重要反应原料甘油三酯（Triacylglycerol,TAG）有着密切关系。与传统油料作物中的GPDH将磷酸二羟丙酮（DHAP）催化还原为3-磷酸甘油（G3P）不同,2020年报道的杜氏盐藻GPDH2含有特殊的双结构域（GPDH-Ser B）和独特的四级结构（四聚体聚合状态）,能够将DHAP直接快速转化为甘油。从代谢通路上看,这一反应消耗了TAG合成的重要前体物质G3P,同时也消耗了合成脂肪酸前体物质乙酰辅酶A（Acetyl-Co A）的碳源,从而抑制了TAG的合成。因此,本研究推测杜氏盐藻GPDH催化的甘油途径可能与TAG生物合成途径是竞争关系,并在此基础上首次选取杜氏盐藻四种含有特殊双结构域的GPDH同工酶为研究对象以初步探讨GPDH与TAG的生成关系。在前期的研究中,我们已成功获得杜氏盐藻四种GPDH（GPDH1、GPDH2、GPDH3和GPDH4）蛋白,并对它们的性质及功能进行了初步探索,且已知它们独特的双结构域与聚合状态对于甘油快速合成反应非常重要。鉴于此,本论文主要将GPDH2作为参考对照与模板蛋白,通过继续解析GPDH1、GPDH3和GPDH4蛋白的空间三维结构,在进一步阐明杜氏盐藻GPDH同工酶结构与其功能特点关系的基础上来探究它们可能对TAG生物合成产生的影响。此外,我们初步尝试了对杜氏盐藻提供胁迫条件来下调GPDH基因的表达量和/或抑制GPDH同工酶的经典GPDH结构域活性,同时检测甘油及TAG生成含量,来探究能否通过抑制杜氏盐藻GPDH从而抑制甘油合成而使碳源流向TAG生成通路,使TAG大量积累。得到的主要结果表明:1.杜氏盐藻GPDH1初步推断为单体,GPDH4可能同时含有多种聚合形态或是已发生变性,而GPDH3经负染测定确为二聚体蛋白且其晶体生长的初步条件目前已成功筛选获得;同时,GPDH1与GPDH4的经典GPDH结构域无活性极有可能是因为它们活性位点的氨基酸发生突变而不能与NAD+进行有效结合。因此,我们初步推测四种GPDH同工酶不同的聚合状态及有无双域活性可能将通过影响甘油的快速合成进而对TAG生物合成产生影响。2.在高盐胁迫下,杜氏盐藻细胞内的甘油及TAG含量增加,这与已报道的研究结果相符,而在加入高磷酸盐抑制GPDH的过程中,没有起到很好的抑制甘油合成的效果;在缺氮胁迫下,TAG生成含量增加与已报道研究结果相符,在经过与高磷酸盐混合处理后,甘油含量均先上升而后急速下降,TAG则呈相反趋势。这表明在GPDH受到抑制的情况下,部分甘油碳源或许流向TAG生成方向,提示TAG生成含量可能确与杜氏盐藻GPDH基因表达下调和/或抑制GPDH同工酶的经典GPDH结构域活性负相关,可继续深入实验进行验证。综上,本论文初步完成了对杜氏盐藻GPDH同工酶蛋白的结构功能以及它们与TAG生成关系的探究,获得的结果不仅丰富了盐藻系统中的蛋白结构数据库,揭示了GPDH蛋白结构与功能的密切关系,同时也为进一步解析藻类生物产油过程中的反应机制提供了理论基础。