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研究背景与研究目的:腹主动脉瘤（AAA）是一类严重危害人类健康的心血管疾病,65岁以上人群的发病率约为8%,其病理特征主要表现为主动脉血管的扩张及血管中膜的增厚重构,腹主动脉呈球囊样凸起且其血管直径超过正常的50%,患者在主动脉破裂之前通常无任何症状,一旦受累处破裂,病人死亡率可达80%。研究表明,AAA与血管平滑肌细胞（VSMCs）表型转化密切相关。CD38是哺乳类细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）主要的降解酶,敲除CD38可以提高细胞内NAD+水平。NAD+作为细胞内循环使用的电子传递体及许多代谢酶如Sirtuins家族等的辅酶或底物,参与诸多细胞生物功能的调节,在细胞代谢、抑制衰老和维持心血管功能稳态等方面发挥着重要作用。既往研究表明SIRT1等参与了小鼠主动脉瘤的发生;我们通过对不同年龄的小鼠主动脉及主动脉瘤转录组的分析发现,CD38在老龄和受累血管中表达增加。这些研究提示CD38可能在小鼠主动脉瘤的发生发展过程中起重要作用。基于血管中膜在主动脉瘤发生中的重要性,我们拟利用血管平滑肌细胞特异性CD38敲除鼠,探讨CD38对腹主动脉瘤发生发展以及对血管平滑肌细胞表型转化的影响及分子机制。实验方法:1.CD38fl/flxCreSMAApoE-/-小鼠的制备及鉴定:我们利用在CD38基因的2号外显子和3号外显子侧翼插入LoxP的小鼠和在平滑肌特异性启动子α-SMA控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交,获得平滑肌细胞特异性敲除CD38基因的纯合子小鼠（CD38flx/flxCreSMA）。随后将 CD38flx/flxCreSMA基因型的 C57BL/6 小鼠与 ApoE-/-背景的 C57BL/6 小鼠杂交,得到 CD38flx/flxApoE-/-及CD3 8flx/flxCreSMAApoE-/-基因型小鼠用于后续实验。2.血管紧张素Ⅱ诱导小鼠腹主动脉瘤模型的建立:血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的腹主动脉瘤模型的具体方法是,选择3个月月龄的CD3 8flx/flxApoE-/-及CD38flx/flxCreSMAApoE-/-的公鼠,通过小动物缓释给药泵持续注射AngⅡ28天,浓度为1000 ng/kg/min。造模结束后,分离小鼠全主动脉,观察主动脉上是否存在球状突起,并通过游标卡尺检测主动脉最大处直径,若超过正常直径的50%,且具有较高的发生率,则判定为该模型构建成功。3.平滑肌细胞特异性敲除CD38对AngⅡ诱导腹主动脉瘤的影响与表型分析:1)造模前及造模期间,我们每周检测小鼠血压情况（尾套法）及腹主动脉扩张情况（在体,小动物腹部超声）。2)造模结束后,分离小鼠全主动脉,观察小鼠腹主动脉瘤形成率;3)通过HE染色、Masson染色、EVG染色观测血管重构情况,包括主动脉外直径、主动脉内直径、纤维化程度、血管中膜厚度和弹性纤维降解程度。4.体外补充NMN对Ang Ⅱ诱导腹主动脉瘤的影响:1)选择10只3个月的CD38flx/flxApoE-/-的公鼠按照上述方法构建AngⅡ诱导的小鼠腹主动脉瘤模型,实验分为两组,3只CD38flx/flxApoE-/-小鼠注射AngⅡ并口服生理盐水作为对照组（生理盐水组）;7只CD38flx/flxApoE-/-小鼠同样注射AngⅡ并口服补充NMN,作为实验组（NMN组）。在注射AngⅡ诱导AAA前,口服给予NMN（400 mg/kg/day）7天,每天一次,并在造模期间按同样剂量每日持续灌胃给药28天,对照组口服等量生理盐水。2)造模结束后,分离小鼠全主动脉,观察体外补充NMN对小鼠腹主动脉瘤发病率及严重程度的影响。5.CD38对AngⅡ诱导腹主动脉瘤的影响及机制分析:我们分别在体内和体外研究了血管平滑肌细胞特异性敲除CD38对表型转化、氧化应激、线粒体稳态、炎性细胞浸润的情况。1)我们通过小鼠腹主动脉组织冰冻切片的免疫荧光染色检测了平滑肌细胞标志物（αSMA、MYH11）、平滑肌表型转化关键转录因子（KLF4）、线粒体融合/裂变相关蛋白（MFN1、DRP1）和炎性细胞浸润（CD68、F4/80）情况;2)我们通过二型胶原酶消化法及组织贴壁法在体外分离培养了小鼠原代主动脉平滑肌细胞,并选用5代以内细胞进行后续实验;3)通过细胞划痕实验评估CD38敲除对平滑肌细胞迁移的影响;4)通过Western blot检测CD38敲除对平滑肌细胞标志物α-SMA、转录因子KLF4、基质金属蛋白酶MMP2和Sirtuins家族的影响。5)通过SIRT1抑制剂检测对平滑肌细胞表型转化的回复作用。实验结果:1.成功构建CD38flx/flxApoE-/-及CD38flx/flxCreSMAApoE-/-小鼠:经琼脂糖凝胶电泳和核酸染料染色显示,CD38flx/flxCreSMAApoE-/-小鼠的CD38flx/flx的目的条带约在313bp处,CreSMA的目的条带约为350bp左右;ApoE-/-基因的目的条带在245bp左右,均与各基因型的目的条带位置相符。同时,Western blot显示,CD38flx/flx CreSMAApoE-/-小鼠血管平滑肌细胞中 CD38表达量为CD38flx/flxApoE-/-小鼠的26%±8.08%。以上结果表明,我们成功构建了可用于后续实验的 CD38flx/flxApoE-/-及 CD38flx/flxCreSMAApoE-/-的小鼠。2.血管紧张素Ⅱ诱导小鼠腹主动脉瘤模型的建立:CD3 8flx/flxApoE-/-小鼠经AngⅡ（1000 ng/kg/min）诱导28天后,大约80%的小鼠可以形成腹主动脉瘤,处于双肾附近隔膜以下的位置,与文献报道一致。对照组主动脉最大处直经为0.93±0.27 mm,实验组主动脉最大处直径为2.05±0.59 mm,主动脉直径扩张为约原来的两倍。表明该方法可以建立稳定的小鼠腹主动脉瘤模型,用于后续实验。3.平滑肌细胞特异性敲除CD38显著抑制AngⅡ诱导小鼠腹主动脉瘤的形成:1)组织免疫荧光显示,腹主动脉瘤组织中,血管平滑肌细胞标志物α-SMA表达量降低,CD38表达量升高。2)在AngⅡ诱导组,CD38flx/flxApoE-/-小鼠（10/12只）主动脉瘤发生率为83%,而CD38flx/flxCreSMAApoE-/-小鼠（0/9只）腹主动脉瘤发生率为0;3)CD38敲除可以抑制AngⅡ引起的小鼠包括收缩压及舒张压在内的血压升高;4)组织学染色结果表明,敲除CD38可明显降低AngⅡ诱导的主动脉血管扩大及血管壁增厚。结果表明,血管平滑肌细胞特异性敲除CD38可以抑制AngⅡ诱导的小鼠腹主动脉瘤发生,减轻AngⅡ引起的血管重构。4.体内补充NMN对AngⅡ诱导的小鼠腹主动脉瘤发生率无明显影响,反而加重其严重程度:结果显示,虽然补充NMN可使AngⅡ诱导主动脉瘤的发病率从对照组的67%降至实验组（NMN）的57%,但口服NMN对AngⅡ诱导腹主动脉瘤的保护作用还有待增加实验数量进一步确认。值得注意的是,我们还观测到,口服补充NMN可加重AngⅡ诱导的小鼠腹主动脉瘤,因为未补充NMN时,AngⅡ诱导的腹主动脉瘤仅限于腹主动脉段,且为单个动脉瘤体,而补充NMN后,其动脉瘤可同时发生在胸主动脉和腹主动脉段等多部位及多个瘤体。此外,口服NMN也不能缩小动脉瘤体的最大直径。5.平滑肌细胞CD38缺失对AngⅡ诱导腹主动脉瘤形成的保护作用及其机制:1)主动脉组织免疫荧光结果表明,CD38敲除抑制AngⅡ引起的平滑肌细胞标志物α-SMA、MYH11降低和表型转化关键转录因子KLF4升高;2)组织活性氧染色和免疫荧光结果表明,CD38敲除可以抑制AngⅡ引起的主动脉壁活性氧增加和巨噬细胞浸润,以及提高线粒体融合蛋白MFN1和动力相关蛋白Drp1表达。3)细胞实验表明:AngⅡ（10-6mol/L）刺激血管平滑肌细胞24小时,可成功诱导α-SMA表达量下调约50%;4)细胞水平上,Western blot结果表明,CD38敲除可以抑制AngⅡ引起的α-SMA下调、KLF4上调、MMP2上调,与动物实验一致;5)细胞划痕实验表明,CD38敲除抑制平滑肌细胞迁移;6)CD38敲除可以显著上调血管平滑肌细胞中SIRT1的表达;7)SIRT1抑制剂Ex527可以减弱CD38对平滑肌细胞迁移的抑制作用。结论1.平滑肌细胞特异性敲除CD38明显抑制AngⅡ引起的小鼠腹主动脉瘤形成和血压升高,其机制与其降低活性氧和抑制血管平滑肌细胞表型转化相关。2.CD38可能通过抑制SIRT1-KLF4信号通路调节血管平滑肌细胞的表型转化,进而促进腹主动脉瘤的形成。3.补充NMN不能保护AngⅡ诱导的腹主动脉瘤,且有加重趋势。