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背景:心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)作为世界上危害人类尤其是中老年人生命健康的主要疾患之一,因其极高的发病率以及近年来的年轻化趋势,而备受广大医者和学者的关注。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)作为心血管疾病中重要一员,其科学实验及临床治疗的研究更是成为热点和难点。已经发育成熟的心肌细胞作为终末分化细胞,当发生心肌梗死时,心肌细胞不同程度受损甚至坏死,功能丧失。临床对于AMI的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗等,都是针对心肌梗死早期用于挽救受损但是还未凋亡的心肌细胞及其功能,但对于已经坏死或凋亡的心肌细胞却是回天乏术。心肌细胞坏死或凋亡,功能性心肌细胞由无功能的成纤维细胞取代进而形成瘢痕组织,心室重构,心脏功能下降,最终导致心力衰竭,导致患者生活质量下降,严重的威胁患者生命。由于心肌细胞损伤的不可逆性,解决心肌细胞的缺失成为心肌梗死治疗的根本问题。随着科学技术的进步,细胞生物工程学的发展使干细胞替代疗法成为治疗心肌梗死的一种新的具有前景的治疗方法。干细胞具有自我复制和多向分化的能力,使干细胞移植治疗心肌梗死成为研究热点。多项基础实验和临床试验已经表明干细胞移植能够修复受损的心肌细胞,促进血管新生,减少梗死面积,促进心脏功能的恢复。自2003年美国FDA率先批准对心肌梗死等疾病采用自体骨髓干细胞移植进行治疗,此后全球范围内开始了干细胞治疗的相关研究,骨髓间充质干细胞是其中应用最为广泛和成熟的。骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)与胚胎干细胞等其他干细胞相比以下优点:具有容易获取,容易分离,体外培养及扩增具有稳定性,没有免疫排斥问题,不涉及医学伦理道德问题,具有多向分化潜能,运用恰当的诱导剂在适当条件下可以分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、心肌样细胞,上述优点使其成为了干细胞移植治疗心肌梗死等心血管疾病的重要种子细胞。BMSCs可以通过与心肌细胞共培养,基因修饰及药物诱导等方法分化为心肌细胞,但其分化率及安全性有待进一步提高。葛根素是葛根的重要成分,它可以影响骨髓间充质干细胞的分化。葛根素及其多种制剂已经通过各种药剂形式广泛应用于临床各种心血管疾病的治疗。葛根素作为中药有效成分,与西药相比,毒副作用更小,使用更安全,临床推广价值显著。目前已有研究发现,葛根素不仅能保护受损心肌细胞、保护心血管,还能在体外诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞,提高心室细胞分化效率。目的:本实验应用葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞,从形态学和分子生物学层面探讨葛根素对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导能力,通过其诱导分化最适浓度的筛选提高分化率,为心肌梗死等心血管疾病的干细胞移植治疗提供理论基础。方法与结果:为了探讨葛根素诱导BMSCs分化为心肌样细胞的可行性,运用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠的四肢骨的BMSCs。对第2代BMSCs分别运用0(对照组)、50、100、200μmol/L葛根素进行体外定向诱导。观察培养细胞的形态,结果可见,BMSCs由0小时的悬浮状态到24小时时均匀贴壁;3天后可见细胞圆钝突起;7天后细胞呈现长梭形等不规则状态。葛根素诱导7天后,细胞增殖加快,细胞形态更加修长;诱导28天后,细胞呈现方向性的紧密排列状态。BMSCs的形态经过不同浓度葛根素诱导无差异。运用流式细胞技术对第3代BMSCs进行表面抗原鉴定,结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性率表达分别为95.1%、7.4%和93.4%。表明细胞为纯化的BMSCs。运用免疫细胞化学检测法检测间隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白I(c Tn I)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T)在诱导4周后各组的表达。结果显示,各诱导组均可见Cx43、c Tn I及c Tn T的阳性表达,空白对照组表达呈阴性,其中100μmol/L诱导组较其他组的阳性表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。运用激光共聚焦荧光技术检测间隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白I(c Tn I)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T),对比诱导4周后对照组与100μmol/L诱导组的表达,提示100μmol/L诱导组呈阳性表达,对照组呈阴性表达,差异显著。运用Western blotting检测法检测间隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白I(c Tn I)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T)在各组诱导4周的BMSCs的表达。结果显示,各组均在蛋白水平表达Cx43、c Tn I及c Tn T,其中100μmol/L诱导组的表达最高,对照组最低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌细胞增强因子2c(MEF2c)在各诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达,检测T-box5和amphiphysin-2(Bin1)在空白对照组与100μmol/L诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达。结果显示,经葛根素诱导后,各个基因的表达与对照组相比整体呈现上升趋势。虽然各个基因的最高表达量呈现在不同时间段,但都出现在100μmol/L诱导组。各诱导组相比,GATA-4的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时,MEF2c的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导2周时。100μmol/L诱导组与空白对照组相比,T-box5的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导1周时,Bin1的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时。相较于其他诱导组,100μmol/L组表达最高(P<0.05)。结论:1.采用全骨髓贴壁法分离培养的SD大鼠四肢骨髓细胞可以纯化为骨髓间充质干细胞。2.不同浓度葛根素可以在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。3.100μmol/L为葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度。