目的肾透明细胞癌(renal Clear cell carcinoma,RCCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,是泌尿外科临床上的主要病种之一。近几年研究表明肾癌(Renal cellcarcinoma,RCC)是多基因相关肿瘤,发病机制复杂,病程发生发展的分子生物学基础至今不明。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP-蛋白偶联的跨膜受体,研究表明趋化因子及其受体在多种肿瘤的发生、生长和转移过程中发挥重要作用。趋化因子受体与很多细胞因子相互作用或受其调控。CXC类趋化因子受体4(chemokine CXC receptor 4,CXCR4)是研究最多的趋化因子受体之一,现有的研究表明CXCR4与肿瘤的发生、发展、浸润和转移关系密切,在很多肿瘤组织及细胞系中有高表达,而且可能受肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子调节;而CCR类趋化因子受体3(chemokine CCR receptor3,CCR3)与肿瘤的发生、发展、浸润和转移关系的研究很少,而且是否和TNF有关还不清楚。有文献报道CXCR4和CCR3参与肾透明细胞癌的发病,但是机制不清楚;TNF-α与CXCR4和CCR3在肾癌中的相互作用也不明了。本实验旨在探讨CXCR4和CCR3在肾透明细胞癌中的表达情况;并通过TNF-α在肾透明细胞癌细胞系中对CXCR4和CCR3表达调节的研究,阐明CXCR4和CCR3在肾透明细胞癌发生、发展及侵袭中的作用及其与TNF-α之间的相互关系。为将来肾透明细胞癌的防治提供新的线索。方法1、本实验选取从2001-2007年中国医科大学附属第一医院泌尿外科手术切除的肾透明细胞癌标本51例。取18例癌旁正常肾组织标本作对照。所有标本均经福尔马林固定,石蜡包埋,4μm厚连续切片,应用免疫组织化学方法(S-P法)检测CXCR4和CCR3在肾透明细胞癌组织及癌旁正常肾组织中的表达情况;并与肾透明细胞癌患者的临床特征及TNM分期(TNM分期按照UICC标准)进行相关性分析。免疫组化结果判定:CXCR4和CCR3表达于细胞内,呈现棕色颗粒为阳性。每张切片随机选取5个高倍视野,每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞的百分数。“—”:细胞没染色;“+”:＜1%细胞染色;“++”:1—10%细胞染色;“+++”:10—50%细胞染色;“++++”:＞50%细胞染色。2、以人肾透明细胞癌细胞系A498和786-0为研究对象,应用RT-PCR方法检测肾透明细胞癌细胞系中趋化因子受体CXCR4和CCR3在mRNA水平的表达情况;应用Western blot方法检测肾透明细胞癌细胞系中趋化因子受体CXCR4和CCR3在蛋白水平的表达情况。3、肾透明细胞癌细胞系中内源性TNF-α的检测:采用Real Time PCR检测肾透明细胞癌细胞系A498和786—0的TNF-αmRNA含量。采用ELISA法检测细胞系A498和786—0培养上清中TNF-α的蛋白含量。4、内源性TNF-α与肾透明细胞癌细胞系中CXCR4和CCR3的相互作用:应用Real Time PCR法检测细胞系A498和786-0中TNF-αmRNA及CXCR4和CCR3mRNA量。采用抗TNF-α中和性抗体处理肾透明细胞癌细胞系A498,分别于处理后3、6、12、24和48小时,采用Real Time PCR检测细胞系CXCR4和CCR3mRNA表达情况,以未经处理的细胞系作为对照。5、外源性TNF-α对肾透明细胞癌细胞系786-0中CXCR4和CCR3 mRNA表达的诱导作用:分别采用1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml TNF-α作用肾透明细胞癌细胞系786-0,分别在1、3、6、12和24小时后,采用Real Time PCR检测细胞系中CXCR4和CCR3 mRNA表达情况,以未经处理的细胞系作为对照。6、统计学分析:所有资料采用SPSS统计软件进行分析。P＜0.05为有统计学差异。结果1、免疫组化结果表明:在肾透明细胞癌组织CXCR4和CCR3呈高表达;正常肾组织中的不表达;CXCR4和CCR3表达与肾透明细胞癌患者年龄、性别及肿瘤大小均无相关性,而与肿瘤TNM分期具有关(P＜0.05)。2、RT-PCR结果:应用RT-PCR方法检测肾透明细胞癌细胞系中CXCR4和CCR3在mRNA水平的表达情况,CXCR4和CCR3在两个肾透明细胞癌细胞系A498和786-0中mRNA水平表达程度有差异,CXCR4和CCR3mRNA在A498中表达显著,而在786—0中表达较弱。3、Western blot结果:以人肾透明细胞癌细胞系A498和786-0为研究对象,应用Western blot方法检测肾透明细胞癌细胞系中CXCR4和CCR3在蛋白水平的表达情况,CXCR4和CCR3在两个肾透明细胞癌细胞系A498和786-0中表达程度有差异,CXCR4和CCR3在A498中表达显著,而在786—0中表达较弱。4、肾透明细胞癌细胞系中内源性TNF-α的表达:采用Real Time PCR检测肾透明细胞癌细胞系A498和786—0的TNF-αmRNA含量。结果显示A498表达高水平的TNF-αmRNA,而786—0表达低水平的TNF-αmRNA,两者相差9.3倍(P＜0.01)。采用ELISA法检测A498和786—0培养上清中TNF-α的蛋白含量:A498培养上清中的TNF-α含量显著高于786—0(P＜0.01)。TNF-αmRNA表达水平和TNF-α蛋白含量相一致。5、内源性TNF-α与肾透明细胞癌细胞系中CXCR4和CCR3的相互作用:采用抗TNF-α中和性抗体处理肾透明细胞癌细胞系A498,分别于3、6、12、24和48小时后,采用Real Time PCR检测细胞系CXCR4和CCR3 mRNA表达情况,以未经处理的A498细胞作为对照。结果显示:经抗TNF-α抗体处理后,A498细胞系中CXCR4和CCR3 mRNA表达水平均较处理前降低,6小时、12小时及24小时与对照比较有明显降低(P＜0.05),其中12小时后降低最为显著,分别降至处理前的30.4%和41.7%(P＜0.01)。6、外源性TNF-α对肾透明细胞癌细胞系CXCR4和CCR3 mRNA表达的调节:分别采用1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml TNF-α作用肾透明细胞癌细胞系786—0,未经TNF-α作用的肾透明细胞癌细胞系786—0作为对照,分别在1、3、6、12和24小时后,采用Real Time PCR检测CXCR4和CCR3 mRNA表达情况。结果显示在上述浓度的TNF-α作用下,肾透明细胞癌细胞系786—0中CXCR4和CCR3mRNA表达均出现不同程度上调(P＜0.05),其中在10ng/mlTNF-α作用下增加最为显著(P＜0.01)。同时结果显示:CXCR4 mRNA和CCR3 mRNA表达在TNF-α作用6小时后增加最为显著。在10ng/mlTNF-α作用6小时后,CXCR4 mRNA和CCR3 mRNA表达分别增加了21.7倍和16.4倍(P＜0.01)。结论1、证明了CXCR4和CCR3在肾透明细胞癌组织中过度表达;CXCR4和CCR3在肾透明细胞癌细胞系中有表达,提示CXCR4和CCR3参与了肾透明细胞癌发病;肾透明细胞癌组织中CXCR4和CCR3的表达与TNM分期密切相关。2、证明了CXCR4和CCR3mRNA和蛋白在肾透明细胞癌细胞系A498中表达显著,在786—0中的表达弱;提示肾透明细胞癌细胞系A498的侵袭力可能比细胞系786—0的侵袭力强;CXCR4和CCR3的表达可能与肾透明细胞癌细胞系的侵袭力密切相关。3、肾透明细胞癌细胞系A498和786—0细胞本身能分泌产生内源性TNF—α,其中A498自主分泌内源性TNF—α的能力强于786—0;提示细胞系A498的侵袭力可能高于细胞系786—0,肾透明细胞癌细胞系分泌内源性TNF—α的能力可能与肾透明细胞癌细胞系的侵袭力有关。4、内源性及外源性TNF—α均可以上调肾透明细胞癌细胞系786—0中CXCR4和CCR3的表达,从而增加细胞系的侵袭力。