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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性疾病,其主要病理特点是滑膜细胞增生,衬里层增厚,多种炎性细胞浸润,血管翳形成,继而引起软骨和骨组织的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失。目前治疗RA的药物可分为非甾体抗炎药、甾体抗炎药和慢作用抗风湿药。由于RA的病因和发病机制仍不甚明了,临床应用受到限制。寻找安全、有效、毒副作用小的治疗RA的中药是今后研究的重要方向之一。中药穿山龙(Dioscorea nipponica Makino),主要成分有穿山龙含薯蓣皂甙(dioscin),纤细薯蓣皂甙(gracillin),穗菝葜甾甙(asperin),25-D-螺甾-3,5-二烯(25-D-spirosta-3,5-diene)及对羟基苄基酒石酸(piscidic acid)。中医作药物为其根茎,有舒筋活络,祛风止痛之功效。大鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)是兼有体液免疫和细胞免疫变化的慢性系统性免疫性炎症,与RA有许多共同的组织学和免疫学特征,是筛选和研究治疗RA药物的较理想模型。本课题在建立大鼠CIA模型的基础上,从整体、器官、细胞、分子、信使RNA基因表达等不同层次研究了Dioscin对CIA大鼠的抗炎和免疫调节作用,并对其部分机制进行了探讨,为开发和利用穿山龙资源,提供理论依据。1Dioscin体内给药对大鼠CIA炎症和免疫反应的影响应用异源性鸡Ⅱ型胶原(CCⅡ)和弗氏不完全佐剂(FIA)建立大鼠CIA模型,用足爪仪测量足爪肿胀度(Δml),同时采用O-4级评分法进行关节评分；检测体重变化情况(Ag)；测定大鼠胸腺指数和脾指数；用ELISA法检测CIA大鼠抗CCⅡ抗体；用螺旋测微计测量两耳厚度之差(Δmm)观察CIA大鼠对CCⅡ的迟发型变态反应；用H&E染色的方法观察病理组织学改变；结果发现CIA大鼠炎症和免疫反应表现为足爪肿胀和多发性关节炎；体重和免疫器官(胸腺和脾)减轻；体内产生抗CⅡ抗体和对CCⅡ的迟发型变态反应；其病理组织学显示炎性细胞浸润、滑膜增厚、关节软骨破坏,与人RA类似,Dioscin30,60,120mg·kg-1,(ig)×7d均能明显减轻CIA大鼠足爪肿胀和多发性关节炎,缓解体重和免疫器官(胸腺和脾)重量的异常变化；对CIA大鼠抗CCⅡ抗体无明显作用；可显著抑制CIA大鼠的迟发性变态反应；Dioscin可明显减轻异常的病理组织学变化,对CIA大鼠病变关节的病理组织结构有明显的改善作用。2Dioscin体内、体外给药对CIA大鼠免疫细胞和细胞因子的作用采用MTT法检测胸腺、脾淋巴细胞增殖反应；用活化的小鼠脾淋巴细胞MTT比色法检测胸腺淋巴细胞产生的IL-2的活性；采用ConA诱导的小鼠胸腺淋巴细胞MTT参入法检测腹腔巨噬细胞产生的IL-1的水平；采用生物学方法检测腹腔巨噬细胞产生的TNF-α的活性；结果表明CIA大鼠ConA诱导的胸腺T细胞增殖反应和IL-2的产生显著增高,LPS诱导的脾B细胞增殖反应无明显变化：腹腔巨噬细胞产生的IL-1和TNF-α的活性明显升高。Dioscin30、60、120mg·kg-1,(ig)×7d和体外0.5、2.5、12.5、62.5、125mg·L-1不同浓度可抑制CIA大鼠过高的胸腺T细胞增殖反应和IL-2的产生；对于腹腔巨噬细胞IL-1、TNF-α的过度产生也有抑制作用。3Dioscin体内、体外给药对CIA大鼠滑膜细胞增殖及其分泌功能的影响RA早期的病变位于滑膜,其滑膜细胞功能的改变直接影响RA病理进程。原代培养细胞离体时间短,其生物学特性和遗传性基本与体内相似,无自发性变异,是细胞形态、机能、分化等研究的理想材料。本文采用MTT法检测滑膜细胞的增殖反应：采用ConA诱导的小鼠胸腺淋巴细胞MTT参入法检测滑膜细胞产生的IL-1的水平；采用生物学方法检测滑膜细胞产生的TNF-α的活性；结果表明CIA大鼠滑膜细胞的增殖反应升高；滑膜细胞产生的IL-1和TNF-α的活性明显升高。Dioscin30、60、120mg·kg1,(ig)×7d和体外0.5、2.5、12.5、62.5、125mg·L-1不同浓度可抑制CIA大鼠过高的滑膜细胞的增殖反应；对于滑膜细胞IL-1、TNF-α的过度产生也有抑制作用。4Dioscin对胶原诱导性大鼠关节炎踝关节滑膜组织中NF-κBp65亚基和COX-2表达的影响为了探讨Dioscin对CIA大鼠炎症免疫反应的作用及其机制,本研究采用Western-blog方法检测CIA大鼠滑膜组织中NF-κBp65亚基和COX-2的表达。研究发现,CIA大鼠滑膜细胞的NF-κBp65亚基和COX-2的表达水平明显高于正常对照组,Dioscin120mg·kgl能显著降低关节炎大鼠踝关节滑膜组织中NF-κBp65亚基和COX-2表达(P<0.01),Dioscin(60mg/kg)和吲哚美辛亦可降低COX-2表达(P<0.05)。提示：GCS通过抑制NF-κBp65亚基和COX-2表达,从而抑制滑膜细胞的增殖反应和细胞因子及炎症介质的分泌而发挥抗炎和免疫作用。综上所述,本文采用体内外研究相结合从整体、器官、细胞、分子、基因表达等不同层次探讨了Dioscin对大鼠CIA的作用及其NF-κBp65亚基和COX-2表达的关系,结果表明Dioscin对大鼠CIA具有治疗作用,其机制与调节机体的免疫功能、抑制炎症性细胞因子的过度分泌和调节NF-κBp65亚基和COX-2表达有关。调节NF-κBp65亚基和COX-2表达可能是GCS发挥抗炎免疫作用的重要分子机制之一。