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大黄鱼是我国养殖产量最大的海水鱼,变形假单胞菌是养殖大黄鱼内脏白点病的病原。本实验室前期分离到大黄鱼内脏白点病的病原菌变形假单胞菌NZBD9,通过转录组数据分析发现变形假单胞菌的secY和dksA基因在感染过程中显著高表达。本文结合RNA干扰和dual RNA-seq技术探讨secY和dksA基因在变形假单胞菌与大黄鱼互作中的功能。首先针对secY和dksA基因的序列分别设计并合成5对shRNA用于沉默株构建,然后用qRT-PCR方法挑选两个基因的沉默效果最好的突变株以10~4 cfu/g鱼体重的剂量通过腹腔注射感染健康大黄鱼来测定病原菌的毒力变化,最后取变形假单胞菌沉默株感染48 h后的大黄鱼脾脏进行dual RNA-seq,并与野生株感染48 h的大黄鱼脾脏的dual RNA-seq数据进行比较分析。主要结果如下:(1)本文设计合成的shRNA都能不同程度降低secY基因和dksA基因的表达量,其中secY基因沉默效果最佳的菌株为secY-shRNA-1165,其沉默效率为82.4%;dksA基因沉默效果最佳的菌株为dksA-shRNA-87,其沉默效率达96.23%。(2)大黄鱼人工感染结果表明,相对于变形假单胞菌野生株注射组,secY沉默株注射组死亡率降低了35%,dksA沉默株注射组死亡率降低25%,沉默株注射后脾脏仅出现少量轻微白色结节,密度明显降低。同等剂量感染后,secY沉默菌株在大黄鱼脾脏、肝脏、肾脏和血液中的载菌量在感染初期都显著低于野生株的载菌量,dksA沉默株感染初期在脾脏中的载菌量也显著低于野生株,secY和dksA沉默株的相对载菌量都随着感染进程而快速上升。这些结果表明,secY和dksA可以参与并影响变形假单胞菌的毒力调控以及感染进程。(3)对变形假单胞菌不同菌株感染48 h后的大黄鱼脾脏dual RNA-seq的数据进行比较分析发现:secY基因的沉默影响了变形假单胞菌的sec分泌系统转位器装置的核心相关基因secG,这可能影响细菌蛋白输出使菌株毒力下降。dksA基因的沉默使病原菌的细胞组分,鞭毛和核糖体组装相关基因大量下调,可能由此降低变形假单胞菌的毒力;fliC基因在感染过程中的显著上调,这有可能是变形假单胞菌毒力维持的一种途径。(4)GO和KEGG富集分析结果显示secY和dksA沉默株感染组的大黄鱼的多个免疫相关通路被影响。其中secY基因沉默主要影响大黄鱼脾脏Toll样受体信号通路、补体和凝血级联受到最显著的影响;dksA基因沉默主要影响大黄鱼脾脏的Toll样受体信号通路、TNF信号通路,造血细胞谱系,细胞因子与细胞因子受体相互作用等4个KEGG通路。综上,secY和dksA是变形假单胞菌的毒力相关基因,这两个基因的沉默能显著降低变形假单胞菌对大黄鱼的毒力,dual RNA-seq结果发现这两个基因的沉默后变形假单胞菌受影响的基因不同,大黄鱼脾脏免疫相关基因对这两个基因沉默株感染的响应也有很大不同。本文用dual RNA-seq初步探讨了变形假单胞菌secY和dksA基因在病原-宿主互作中的功能,结果有助于增进对变形假单胞菌致病性的认识,也为研究水产病原菌的致病机制提供一个参考。