研究背景足细胞是终末分化的脏层上皮细胞,在维持正常的肾小球滤过屏障功能当中发挥了重要作用。足细胞的损伤、脱落和凋亡是糖尿病肾病患者出现蛋白尿的主要原因,最终可进展为持续的肾功能损害。糖尿病肾病常常合并有脂代谢的异常,表现为血清中甘油三酯的升高,其中血清中游离脂肪酸(FFA)水平与糖尿病肾病的发生、发展密切相关。自噬是真核细胞通过溶酶体降解细胞内错误折叠的蛋白质和受损伤的细胞器的过程,对稳定细胞内环境、维持细胞的正常代谢和存活具有重要意义。研究表明,自噬与多种肾脏疾病的发生发展密切相关,比如急性肾损伤(AKI),局灶节段性肾小球硬化症(FSGS),糖尿病肾病(DN)等其他疾病,而且大量研究表明自噬可以作为糖尿病肾病未来的潜在治疗靶点,但自噬在脂质诱导的肾小球足细胞凋亡中的具体作用及机制,还需进一步的研究。目的本文拟通过研究棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导的足细胞自噬与凋亡,以进一步阐明自噬在高脂诱导的足细胞凋亡中的作用及可能机制,旨在探讨自噬在脂代谢紊乱导致足细胞凋亡中的作用,为临床治疗糖尿病肾病提供新的实验基础和理论依据。方法(1)体外培养条件永生性小鼠足细胞株,待其分化完全后,用不同浓度PA及不同时间刺激已分化的足细胞,Western印迹检测足细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3及溶酶体相关膜蛋白LAMP-2的表达。进一步采用免疫荧光单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色观察PA(150μmol/L)刺激下足细胞内的自噬颗粒的变化。GFP-LC3慢病毒感染足细胞,经嘌呤霉素筛选稳定珠,通过PA(150μmol/L)刺激24 h,观察GFP-LC3荧光颗粒及进一步与溶酶体相关膜蛋白LAMP-2染色共定位检测足细胞自噬小体及自噬溶酶体的变化情况。(2)通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,2mmol/L)和氯喹(Chloroquine,CQ,3μmol/L)预处理足细胞,采用GFP-LC3免疫荧光及Western印迹检测PA(150μmol/L)刺激下足细胞内自噬流的变化。(3)采用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC,150μmol/L)预处理足细胞,DCFH-DA(10μM)染色观察PA诱导下足细胞内ROS的变化,进一步用GFP-LC3免疫荧光及Western印迹检测足细胞内自噬情况。(4)用油红“O”染色及BODIPY500/510 C1,C12(10μg/ml)染色检测PA刺激下足细胞内脂质集聚情况,JC-1染色检测PA刺激下足细胞内线粒体膜电位变化情况。(5)采用不同浓度PA刺激足细胞,流式细胞计数检测足细胞凋亡,Western印迹检测Cleaved-caspase3的表达情况,采用抗氧化剂NAC(150μmol/L)预处理足细胞,Western印迹检测Cleaved-caspase3的表达情况。(6)用CQ和雷帕霉素(Rapamycin,Rap,1ng/m L)分别预处理抑制或促进足细胞自噬,通过PA(150μmol/L)刺激24 h,DCFH-DA染色观察足细胞内ROS水平,流式细胞计数检测足细胞凋亡情况。结果(1)与对照组相比,PA可以呈时间和浓度依赖性增加足细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3及溶酶体相关膜蛋白LAMP-2的表达,PA刺激可以诱导足细胞自噬小体及自噬溶酶体的形成增加。(2)自噬抑制剂3-MA可以抑制高脂诱导的足细胞自噬小体的形成导致GFP-LC3自噬荧光颗粒的形成减少,CQ可以抑制高脂诱导的足细胞自噬小体的降解导致GFP-LC3自噬荧光颗粒的大量堆积。(3)PA可以增加足细胞内ROS的产生,而抗氧化剂NAC可以减少足细胞内ROS的产生和减轻自噬。(4)PA可以增加足细胞内的脂质集聚,线粒体膜电位的下降。(5)PA可以呈浓度依赖性增加足细胞的凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表达,而抗氧化剂NAC可以减少PA诱导的足细胞凋亡。(6)采用自噬抑制剂CQ预处理足细胞后,CQ可以进一步增加PA诱导下的足细胞内ROS的产生和加重足细胞的凋亡,而自噬激活剂Rap预处理后,Rap可以减少PA诱导下的足细胞内ROS的产生和减轻足细胞的凋亡。结论(1)PA可以诱导足细胞内的脂质集聚、线粒体损伤、自噬的激活和细胞凋亡。(2)PA诱导的自噬与凋亡主要与足细胞内产生的ROS相关,而ROS的产生主要来源于受损伤的线粒体。(3)激活的自噬可清除PA诱导的足细胞内过量产生的ROS以减少足细胞的凋亡。