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目的:
1.通过各种筛选方法筛选出乙肝病毒e抗原(HBeAg)来源的HLA-A0201限制性CTL表位并鉴定其具有免疫原性，为HBeAg多T细胞表位的特异性治疗性疫苗的开发奠定基础。
2.利用分子生物学技术构建CD40L基因修饰的HBeAg多T细胞表位DNA疫苗。
3.探讨HBV E-ecdCD40L融合基因对树突状细胞(DC)功能的影响。
方法:
1.选择中国人群最常见的B基因型中的adw血清型的乙肝病毒e抗原序列，通过网络在线表位筛选服务，分析得到分数比较高，而且是一样的表位，然后采用量化基序方案、延展基序方案以及超基序方案等通用表位筛选原则进行进一步的筛选，得到4条较为理想的九肽(HBe1，HBe2，HBe3，HBe4)作为候选表位。随后借助于流式细胞技术，通过T2细胞实验分析各候选肽以及阳性、阴性、空白对照的荧光系数，从而对所筛选的表位进行体外鉴定。
2.利用HBeAg的T细胞表位抗原序列及CD40L胞外段基因特异性引物，扩增HBeAg的表位抗原序列及CD40L胞外段基因全长序列（其中HBeAg的表位抗原序列是由之前筛选并经过鉴定的表位片段通过GPGPG连接，再融合通用型辅助性T细胞表位PADRE基因而成），两段基因通过酶切连接构建HBVE-ecdCD40L融合基因并通过PCR扩增，融合基因定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组质粒pcDNA3.1-E-ecdCD40L，并经酶切和测序分析鉴定。
3.应用DNAStar软件和www.expasy.org网站提供的在线服务分析融合基因蛋白HBeAg-ecdCD40L的柔性、亲水性、抗原性等性质，并对其做二级结构的模拟分析。
4.分离健康成人外周血单个核细胞，利用含GM-CSF和IL-4、TNF-α的RPMI-1640培养液诱导出树突状细胞，并用倒置显微镜观察DC形态变化。DC诱导培养第5天，利用脂质体介导质粒转染，共分为4组，A组为pcDNA3.1-E-ecdCD40L转染组，B组为pcDNA3.1-E转染组，C组为pcDNA3.1转染组，D组为PBS对照组。转染48h后，收集DC，并用流式细胞术分析转染前后DC表面的CD80、CD86和人类白细胞抗原(HLA)-DR的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DC上清中IL-12p70的分泌水平，以及CCK-8法观察转染重组质粒的DC促进T细胞的增殖效应。
结果:
1.筛选获得4个候选表位(HBe1:LLWFHIS CL，HBe2:YLVSFGVWI，HBe3:CLTFGRETV, HBe4:DLLDTASAL)，通过T2细胞实验发现其中HBe2和HBe3的亲和力较高;HBe1，HBe2和HBe3的稳定性较好。
2.根据前期实验结果，我们选择117-125 CLTFGRETV和128-136YLVSFGVWI两条表位肽构建重组质粒，经酶切和测序证明成功构建pcDNA3.1-E(117-125、128-136)-ecdCD40L重组质粒。
3.HBV E(117-125、128-136)-ecdCD40L融合基因蛋白序列与设计一致，重组质粒pcDNA3.1-E(117-125、128-136)-ecdCD40L包含了HBV E(117-125、128-136)-ecdCD40L融合基因。软件分析融合蛋白HBV E(117-125、128-136)-ecdCD40L的氨基酸序列，及HBeAg的两条T细胞表位连接片段和CD40L胞外段的氨基酸序列，并将其结果比较，发现融合蛋白在二级结构上几乎没有变化，亲水性、抗原性等生物学活性也未受影响，Linker部位抗原性低、中性、柔性高也不影响两端蛋白质的二级结构及融合蛋白空间构象。
4.分离出的外周血单个核细胞，经GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子联合诱导，成功培养出具有典型形态特征的树突状细胞。倒置显微镜下见细胞表面粗细不等的树枝样突起。
5.重组质粒能促进DC成熟，流式检测出DC表面的CD80、CD86和HLA-DR的表达水平分别为:A组（45.36±11.25％、83.05±1.92％、69.73±15.08％）高于B组(30.75±9.02％、78.53±1.99％、52.68±13.26％)及C组(26.82±4.64％、78.02±3.01％、49.29±13.51％)和D组(24.48±6.57％、76.18±2.78％、47.63±16.06％），差异有显著性(P＜0.05)。而B组虽高于C组和D组，但差异均无显著性(P＞0.05），另C组和D组也无显著性(P＞0.05)。
6.ELISA检测DC分泌IL-12p70水平结果:DC分泌IL-12p70水平，A组(116.78±42.31pg/ml)高于B组（89.31±27.11pg/ml）及C组（74.36±23.53pg/ml）和D组（70.52±25.28pg/ml）差异有显著性(P＜0.05); B组IL-12p70分泌水平略高于C组和D组，但差异均无显著性(P＞0.05)C组和D组差异也无显著性(P＞0.05)。
7.CCK-8法检测混合淋巴细胞反应中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力结果:DC刺激淋巴细胞增殖的能力随着DC/T比例的增高而增强。当DC/T比值为1∶5、1∶10、1∶20时， A组的刺激指数高于B组、C组和D组，差异有显著性(P＜0.05);B组的刺激指数高于C组和D组，但差异无显著性(P＞0.05);C组和D组差异无显著性(P＞0.05)。
结论:
1.YLVSFGVWI和CLTFGRETV是乙肝病毒e抗原潜在的HLA-A0201限制性CTL表位，有可能作为HBV慢性感染治疗性DNA疫苗的候选表位，有待下一步通过体内试验对其免疫原性作进一步的验证。
2.成功构建pcDNA3.1-E(117-125、128-136)-ecdCD40L重组质粒，设计合理并保留了HBeAg和CD40L胞外段的生物学活性。
3.HBV E(117-125、128-136)-ecdCD40L融合基因可活化DC、促进DC成熟，并能增强DC功能。与其他对照组相比，由HBV E(117-125、128-136)-ecdCD40L融合基因修饰后的DC表面分子CD80、CD86、HLA-DR表达水平增高，分泌IL-12 p70的水平也增高，且刺激同种异体淋巴细胞的增殖能力也增强。因此，真核表达载体pcDNA3.1-E(117-125、128-136)-ecdCD40L的成功构建为新型乙肝多表位DNA疫苗进一步的体内免疫实验研究奠定了基础。