前言:　　 上皮间质转化(EMT)起初是由发育生物学家在对胚胎发育过程中上皮细胞特异的形态改变进行描述并命名的。具体是指上皮细胞在形态上失去极性，变得类似于成纤维细胞，与周围细胞和基质粘附性下降，并获得了较强的迁徙运动能力。随着分子生物学和细胞生物学方法的运用及相关研究的深入，人们发现EMT不仅仅是细胞形态及运动能力的改变，同时还伴有上皮和间质特异性标志物的表达改变。诸如E-钙粘素、桥粒斑蛋白、紧密连接蛋白、角蛋白、α-连环素、β-连环素、γ-连环素等上皮细胞标志性蛋白在EMT中出现表达下调;另一方面N-钙粘素、α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白等间叶组织标志物则呈现表达上升的现象;此外还同时诱导EMT相关的蛋白酶、细胞因子及转录因子的表达或表达上调，如基质金属蛋白酶-2/9、转化细胞成长因子、成纤维细胞成长因子、Snail，Slug，Twist，FSP-1等。随着研究的进一步深入，近期报道显示EMT导致细胞运动迁徙能力及蛋白表达的改变不仅在胚胎发育过程中发挥作用，还与肿瘤恶性演进及肿瘤治疗耐药密切相关。因此，EMT的相关研究愈发受到学者、临床医学工作者和医药公司等多方的重视。　　 大量文献显示:T-box家族成员一转录因子Brachyury在EMT过程中扮演着诱导作用。T-box家族成员的共性是含有可与DNA结合的高度保守的功能域，被称为T-功能域。Brachyury与T-box家族的其他成员相似，均是中胚层分化过程中的保守蛋白，早期研究提示其在脊索发育形成的过程中发挥功能。在离体实验中，Brachyury可以诱导恒河猴胚胎干细胞发生间质分化。Kilic和Palena等人在研究中发现，Brachyury可能通过诱导EMT影响结肠癌和前列腺癌的恶性表型，这使得人们认识到Brachyury在肿瘤发生发展中可能扮演重要角色，并有可能成为新的肿瘤药物治疗靶点。但是目前Brachyury在肺癌中的研究甚少，机制尚不清楚，引起了我们深入研究的兴趣。　　 人类所有恶性肿瘤中，肺癌发病率和致死率均排在首位，这其中又以非小细胞肺癌(NSCLC)为主，约占80％左右。尽管相对于小细胞肺癌，NSCLC可以通过手术和放化疗进行综合治疗，并可根据基因表型辅以分子靶向治疗，但NSCLC的临床疗效仍没有突破性进展。因此完善肺癌发生发展的机制、探讨肿瘤耐药机制以及探索新的药物靶点均是亟待解决的任务。我们在前期研究中发现人正常肺组织几乎无法检测到Brachyury的表达，但在NSCLC患者的肿瘤组织中出现Brachyury表达上调的表型。据此并结合Brachyury在EMT过程中的诱导功能，我们推测Brachyury在NSCLC中出现表达上调，并通过诱导EMT加剧肿瘤的恶性演进。　　 在本研究中，我们检测了115例NSCLC样本中Brachyury的表达情况并探讨了它的表达与EMT及临床病理因素的关系。同时，在肺癌细胞系中分别过表达或干扰Brachyury，借助免疫蛋白印迹、四甲基偶氮苯唑盐和基质胶侵袭实验等方法探讨了Brachyury表达对肺癌细胞EMT、增殖和侵袭的影响。在此基础上，通过观察干扰Brachyury表达及化疗药物处理后细胞活性及增殖能力的改变，研究Brachyury对NSCLC化疗药物敏感性的影响。　　 材料与方法:　　 一、组织标本与病人资料　　 115例NSCLC患者的标本及20例癌旁正常肺组织（距原发性肿瘤边界5cm以上）标本收集自辽宁省肿瘤医院病理科2007年存档蜡块。所有病例术前均未接受放疗和化疗，并具有详实随访资料。男性80例，女性35例，男女性别比约2.29∶1，年龄47～86岁（中位年龄67.3岁）。按照International Union Against Cancer(UICC)于2009年修订的肿瘤pTNM分期标准:Ⅰ期40例，Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期42例。按照World Health Organization(WHO)肺癌分类标准:鳞癌70例，腺癌45例。为了验证免疫组化的结果，我们另外收集了30例新鲜肺癌及癌旁正常肺组织用于检测Brachyury蛋白和mRNA的表达情况。　　 二、免疫组织化学染色　　 采用Streptavidin-Peroxidase(SP)免疫组织化学方法进行染色，检测Brachyury、E-cadherin和N-cadherin在115例NSCLC标本中的表达，并通过统计学分析Brachyury与各临床病理参数、E-cadherin及N-cadherin之间的关系。 Brachyury阳性结果的判定参考Lu等的标准。光镜下计数400个肿瘤细胞，以免疫染色的强度(0=negative，1＝weak，2＝moderate，3=strong)和免疫染色的阳性细胞数(0=absent，1=1～25％，2=26～50％，3=51～75％，4=≥76％)两项评分相乘得到的分数作为每例标本的最终分数，＜2分为阴性表达，≥2分为阳性表达。　　 三、细胞培养，质粒构建与转染　　 人肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1（以下称SPC）培养于含10％ FBS的RPMI1640培养基中。将Brachyury质粒(pCMV5-FLAG/Brachyury)导入Brachyury表达较低的SPC细胞系;选择干扰效果较好的Brachyury siRNA序列（5-CUACGUUGACUUCUACUCAUU-3,5-UGAGUAGAAGUCAACGUAGUU-3）导入Brachyury表达较高的A549细胞系。　　 四、Western Blotting与RT-PCR　　 应用Western Blotting测肺上述细胞系中Brachyury的蛋白表达情况。应用RT-PCR测肺癌、癌旁正常肺组织中Brachyury的mRNA表达情况。　　 五、四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力　　 处于对数生长期的NSCLC细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液（细胞密度3×105个/ml），分别接种于4个96孔板培养板，每板分4组:空白组，干扰对照组、Brachyury siRNA干扰组、pCMV5-FLAG/Brachyury质粒组。培养第24、48、72、96小时后分别加入MTT(5mg/ml)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μlDMSO溶解结晶，选择波长490nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。实验重复3次。绘制细胞生长曲线。　　 六、基质胶侵袭实验　　 将Transwell小室底部用RPMI1640培养基1∶8稀释的Matrigel胶覆盖，约50μg/小室。制备好的小室用紫外线照射2h杀菌，使用前加入少量无血清培养基水化。小室下室加入0.5ml含1％胎牛血清的RPMI1640培养基，上室分别加入预检测的细胞，调整细胞浓度为1.5×10个/ml，每组4个复孔。37℃、5％CO2培养48h后，取出小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，95％乙醇溶液固定，0.5％亚甲蓝染色。在倒置显微镜(200×)下计数微孔膜下层的细胞数。　　 七、化疗药物耐药性分析　　 在细胞的培养基中分别加入1，3，5μg/ml的DDP，继续作用24h，MTT法检测细胞毒性指数。实验重复3次。　　 结果:　　 一、Brachyury在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关　　 Brachyury在正常肺组织细胞胞浆中呈现阴性或弱阳性的信号，根据我们的评分标准判定为阴性表达。在肺癌组织中Brachyury的阳性信号定位于胞核，伴有少量胞浆表达，其阳性表达率为40.87％(47/115)，明显高于正常肺组织的表达水平(P＜0.001)。　　 Brachyury的阳性表达与患者临床病理因素的关系见表2。肺腺癌中的阳性表达率为55.56％(25/45)，明显高于鳞癌的31.43％（22/70;P=0.01）;Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率为57.14％(24/42)，显著高于Ⅰ～Ⅱ期的31.51％(23/73; P=0.007);有LN转移的病例阳性表达率是59.26％(32/54)，显著高于无LN转移病例的24.59％(15/61;P＜0.001)，但Brachyury的阳性表达与患者年龄、性别和分化程度均未见关联性（P＞0.05）。　　 Kaplan-Meier生存分析表明，与Brachyury阴性表达的患者相比，Brachyury阳性表达患者的平均生存时间显著缩短(49.84±2.25 vs.28.93±2.41月，Log-Rank检验P=0.001)，表明Brachyury的阳性表达与NSCLC患者的不良预后有关。　　 二、肺癌组织中Brachyury的mRNA与蛋白表达明显增加　　 为了验证免疫组化结果，我们应用RT-PCR和Wester Blotting检测了30例患者的肺癌标本与相应的癌旁正常肺组织中Brachyury的mRNA与蛋白表达情况。30例癌旁正常肺组织Brachyury的mRNA和蛋白的平均灰度值分别为0.18±0.11与0.24±0.18，而配对肺癌组织的mRNA与蛋白的平均灰度值分别为0.81±0.06与1.01±0.17，表达均明显增加（P均＜0.05）。　　 三、肺癌组织中Brachyury表达上调对N-cadherin、E-cadherin表达的影响　　 肺癌组织连续切片免疫组织化学检测显示，Brachyury阴性的肺癌组织中，E-cadherin高表达，并呈现出清晰的膜着色，而N-cadherin往往相应的为低表达;而Brachyury阳性高表达的肺癌组织中，E-cadherin表达显著降低，且已无明确的膜着色，而N-cadherin相应增高，且膜着色明显。　　 四、Brachyury能促进肺癌细胞增殖　　 为了检测Brachyury对细胞增殖能力的影响，我们利用MTT方法检测了过表达或干扰Brachyury后肺癌细胞增殖能力的变化。过表达或干扰Brachyury后24h，各组细胞的增殖能力并未出现明显的差别(P＞0.05)。但从第2d起，过表达Brachyury的肺癌细胞的增殖能力明显高于对照组（图6A，P均＜0.05），而干扰内源性Brachyury组瘤细胞的增殖能力显著低于对照组（图6B，P均＜0.05）。　　 五、Brachyury可促进肺癌细胞的侵袭　　 在证实Brachyury能够改变肺癌细胞增殖能力之后，我们又利用侵袭实验检测了Brachyury对肺癌细胞侵袭能力的影响。利用血清刺激的基质胶侵袭实验显示，过表达Brachyury后48h，平均侵袭的细胞数为55.33±4.39个，明显高于对照组的21.25±5.55个(P＜0.01);而在干扰Brachyury后48h，平均侵袭的细胞数为19.17±2.89个，显著低于相应对照组的63.47±2.93个（P＜0.01）。　　 六、干扰Brachyury提高细胞对化疗药物DDP的敏感性　　 分别使用1，3，5μg/ml DDP处理的DDP处理组细胞的OD490分别为0.601±0.022，0.572±0.016，0.487±0.021;而对应的沉默化疗组细胞的OD490分别为0.497±0.032，0.443±0.012,0.338±0.043。　　 使用1，3，5μg/ml DDP处理DDP处理组细胞的生长抑制率分别为（7.63±1.97）％，(16.41±3.71)％，（25.32土6.27）％;而对应的沉默化疗组细胞的生长抑制率分别为(24.93±7.97)％，(33.27±5.71)％，(49.32±11.47)％。相同DDP使用量的两组细胞之间的生长抑制率存在明显的统计学差异(p＜0.05)，联合处理组的细胞毒效更强，其细胞增殖能力受到更明显的抑制。　　 结论:　　 1、Brachyury在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。　　 2、Brachyury在肺癌组织和肺癌细胞系中表达上调与N-cadherin表达正相关，与E-cadehrin表达负相关，并增强细胞的增殖和侵袭能力。　　 3、Brachyury表达上调可导致肺癌细胞系A549化疗药物敏感性降低。