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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种以母猪繁殖障碍及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征的病毒性传染病。自1987年首次在美国出现以来,一直是世界养猪业防控的难题。而在我国白2006年夏季以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株的出现和流行更是给我国养猪业造成了难以估量的损失。PRRSVGP5蛋白是由ORF5基因编码,是其主要的免疫保护性蛋白,GP5和M蛋白共表达能够形成异源二聚体,且这种异源二聚体能够促进GP5蛋白从内质网向高尔基体转运,从而增强GP5蛋白所诱导的免疫反应。而N蛋白是PRRSV含量最高的结构蛋白,也是免疫原性最强的病毒蛋白,虽然N蛋白所诱导的抗体不具备中和病毒的能力,但N蛋白能诱发机体产生强劲的细胞免疫反应。病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)在形态上与天然病毒粒子相同或相似,因此具有很好的免疫原性,同时由于其不含病毒核酸,所以安全性高,在疫苗研究中具有广阔的应用前景。而杆状病毒表达系统因其表达外源蛋白的含量高且安全性强而被广泛用于VLPs组装的研究。为了获得更加安全高效的PRRSV基因工程疫苗,本研究构建了共表达PRRSVGP5,M和N蛋白的重组真核表达质粒,并在小鼠模型上对其免疫原性进行了评价,同时以杆状病毒表达系统初步探讨了参与组装PRRSV病毒样颗粒的结构蛋白。主要研究内容如下：1.重组真核表达质粒的构建利用PCR和酶切的方法将PRRSV WUH3株的ORF5、ORF6、ORF7插入真核表达质粒pcDNA3.1中,构建了单独表达GP5蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-ORP5、共表达GP5和M蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-ORF5/6和共表达GP5、M和N蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1-ORF5/6/7,并经Western blot证实各表达质粒在体外培养细胞中均能有效表达目的蛋白。2. PRRSV GP5-ELISA的建立将实验室构建的表达GP5蛋白的原核表达质粒pKG-ORF5转化大肠杆菌,IPTG诱导表达后,提取包涵体并纯化,进行SDS-PAGE分析,得到大小为38KD的重组GST-GP5,以该蛋白为抗原建立了检测GP5特异性抗体的ELISA方法。3.重组真核表达质粒免疫小鼠后诱导的体液免疫反应为了探讨N蛋白能否增强GP5和M蛋白的免疫原性,将真核表达质粒pcDNA3.1-ORF5、pcDNA3.1-ORF5/6和pcDNA3.1-ORF5/6/7以及空白载体pcDNA3.1分别免疫BALB/c小鼠,进行体液免疫反应的评价,结果GP5和M蛋白共表达的质粒pcDNA3.1-ORF5/6及GP5、M和N蛋白共表达的质粒pcDNA3.1-ORF5/6/7所诱导的中和抗体和针对GP5蛋白的ELISA抗体均显著高于单独表达GP5蛋白的pcDNA3.1-ORF5免疫组,但pcDNA3.1-ORF5/6免疫组和pcDNA3.1-ORF5/6/7免疫组所诱导的体液免疫反应无显著差异。4.重组真核表达质粒免疫小鼠后诱导的细胞免疫反应在DNA疫苗免疫后第5周,断颈处死小鼠,分离脾淋巴细胞,经灭活的PRRSV刺激后,荧光定量和ELISA检测IFN-γ的表达,结果GP5和M蛋白共表达及GP5、M和N蛋白共表达所诱导的IFN-y水平均显著高于单独表达GP5的质粒所诱导的IFN-y水平,而GP5、M和N蛋白共表达的质粒所诱导的IFN-y水平又显著高于GP5和M蛋白共表达质粒的免疫组(P<0.05),研究表明,GP5、M和N蛋白共表达能增强细胞免疫反应。5.杆状病毒表达系统介导的PRRSV病毒样颗粒组装的研究将本实验室构建的重组转移质粒pFastBac-ORF5/6、pFastBac-ORF5/6/7和pFastBac-ORF2/5/6/7分别转化DH10Bac大肠杆菌,获得重组Bacmid-ORF5/6、 Bacmid-ORF5/6和Bacmid-ORF5/6,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-ORF5/6、BV-ORF5/6/7和BV-ORF2/5/6/7,在证实目标蛋白在重组杆状病毒中正确表达后,超离纯化重组杆状病毒的细胞培养上清,经电镜观察3种重组病毒的细胞培养上清中均有PRRSV VLPs形成,但以ORF5、ORF6、ORF7和ORF2b4基因共表达的重组杆状病毒培养上清中病毒样颗粒的数量最多,说明共表达GP5和M蛋白即可形成PRRSV VLPs,而GP2b可能有助于VLPs的释放。