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肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性（Drug resistance）是造成化疗失败的主要原因。虽然肿瘤细胞耐药的机制十分复杂,但研究显示一些关键酶在这一过程中发挥重要作用,其中谷胱甘肽S-转移酶P1（Glutathione S-transferases P1,GSTP1）是最受研究人员关注的耐药相关酶之一。GSTP1在很多耐药肿瘤细胞中高表达,且GSTP1的高表达与癌症病人的不良预后密切相关。因此,在肿瘤耐药机制的研究领域中,对GSTP1的研究一直备受重视。由于GSTP1可催化还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）与异生物质亲电结合,继而促进细胞解毒,因此大多数研究均将GSTP1的转移酶活性与其在耐药中的作用相关联。但是,一些化疗药物（如Adriamycin,ADR）并不是GSTP1的酶底物,因而无法用GSTP1的转移酶酶活性来解释GSTP1在一些肿瘤细胞中导致耐药的机制。近些年来,国外和我们实验室陆续报道了 GSTP1可以通过非转移酶活性调控细胞信号途径（如丝裂原活化蛋白激酶,Mitogen-activated protein kinase,MAPK信号途径）,在肿瘤细胞凋亡调控中发挥重要作用的功能。这些研究提示,GSTP1可能通过其他非酶活途径导致肿瘤细胞耐药,但至今GSTP1促进肿瘤细胞耐药的机制尚未明确。MCF-7是一种人乳腺癌细胞株,在ADR敏感的MCF-7细胞（MCF-7）中GSTP1的水平极低,而ADR耐药的MCF-7细胞（MCF-7/ADR）具有高水平的GSTP1,两种细胞中的GSTP1含量相差很大。我们通过对ADR耐药细胞MCF-7/ADR和ADR敏感细胞MCF-7研究,发现了 GSTP1通过促进细胞自噬导致耐药的一种新机制,我们的实验结果如下。我们通过在MCF-7过表达GSTP1和在MCF-7/ADR中敲减GSTP1,证实了高表达GSTP1能够导致MCF-7细胞耐药;利用GSTP1酶活缺失变体GSTP1（Y7F）和GSTP1抑制剂6-（7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑-4-硫）己醇（6-（7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ylthio）hexanol,NBDHEX）,明确了GSTP1酶活性在MCF-7对ADR耐受中并没有发挥主导作用,并且MCF-7耐受ADR也非依赖于 GSTP1 对 c-Jun N 末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）的调控。肿瘤细胞耐药的过程中通常伴随着较高水平的自噬（Autophagy）,而自噬作为维持细胞稳态的一种细胞生理途径,被认为可以促进肿瘤细胞的耐药。我们比较了 ADR耐药细胞MCF-7/ADR和ADR敏感细胞MCF-7的自噬水平,电子显微镜观察、免疫印迹等实验结果显示,在ADR刺激下,MCF-7/ADR的自噬水平显著高于MCF-7细胞。在MCF-7细胞中过表达GSTP1和在MCF-7/ADR中RNA干扰实验均显示GSTP1可以提高细胞的自噬水平。同时,蛋白免疫印迹实验结果显示GSTP1的转移酶活性对于调控细胞自噬水平无显著性影响。进一步使用自噬抑制剂显示,抑制GSTP1上调的自噬则能够显著降低MCF-7/ADR细胞的耐药性。上述结果表明GSTP1能够通过提高细胞自噬水平促进细胞耐药。通过比较ADR刺激下MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞自噬上游通路,我们发现MCF-7/ADR细胞中PI3K-Akt-mTOR通路的激活程度显著低于MCF-7细胞,而两种细胞中ERK的激活水平相同,由此推测GSTP1可能通过PI3K-Akt-mTOR途径调节自噬。在MCF-7细胞中的GSTP1过表达和MCF-7/ADR中的RNA干扰实验进一步显示,在ADR刺激下,GSTP1确实通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路来调控自噬。免疫共沉淀和质谱实验结果表明GSTP1与PI3K的催化亚基p110α结合,而不与PI3K的调节亚基p85α以及其下游的Akt及mTOR结合。GSTP1与p110α结合抑制了 p110α的磷酸化,继而阻断PI3K-Akt-mTOR通路的激活,最终上调了细胞自噬水平。分子对接模拟显示,GSTP1 C末端α螺旋的Pro123、Leu160和Glu163可能为GSTP1-p110α复合体的形成的关键氨基酸。为此,我们构建了 Pro123、Leu160和Glu163突变的GSTP1质粒,免疫共沉淀等实验结果显示Pro123、Leu160和Glu163三个氨基酸均突变的GSTP1突变体与p110α的结合显著减少,且在MCF-7细胞中过表达该GSTP1突变体不能增强细胞的自噬和细胞对ADR的耐药性。这些结果表明GSTP1 C末端α螺旋的Pro123、Leu160和Glu163为GSTP1与PI3K的p110α结合的关键氨基酸,Pro123与相邻的Gly124形成的弯曲结构以及Leu160和Glu163所在GSTP1底物结合口袋区域,为GSTP1与p110α的结合提供了构象空间。GSTP1通过调节自噬促进细胞耐药的功能同样在另外一种乳腺癌细胞系MDA-MB-468中得到验证,提示GSTP1的这种功能可能在多种肿瘤细胞的耐药中均存在。综上所述,GSTP1通过其配基结合活性在其C末端α螺旋结构域与PI3K催化亚基p110α结合,抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路继而促进细胞的自噬,最终导致乳腺癌细胞对ADR的耐药。本研究的特色和创新之处:1.首次发现了 GSTP1能够通过促进细胞自噬导致乳腺癌细胞对ADR的耐药,是一种GSTP1促进肿瘤对化学药物耐受的新机制。2.阐明了 GSTP1通过与PI3K催化亚基p110α的结合抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路进而调节细胞自噬的分子机制。即:GSTP1通过其C末端α螺旋结构域与p110α相互作用抑制了下游信号分子的激活,进而通过影响mTOR信号通路促进了乳腺癌细胞的自噬,促进其对ADR的耐受。