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流行病学证据表明,更年期后女性阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病率是男性的两倍,抑郁症的患病比率增加了一倍,提示卵巢功能衰竭导致的性激素尤其是雌激素(estrodiol,E2)水平降低与AD和抑郁症的发病有关。临床资料显示,女性在体内E2水平剧烈下降时期易患抑郁症。近年来,虽然雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy,ERT)作为AD和抑郁症的辅助治疗手段已应用于临床,但其效果并不明确。如,50-63岁期间接受6个月以上E2治疗的女性与同龄非E2治疗女性相比,其老年(>78岁)AD发病率明显降低,而65岁以后E2治疗无作用。迄今,有关更年期/后E2水平降低在AD和抑郁症发病过程中的作用及其机制仍然不清楚。此外,E2在干预治疗AD的有效时间窗也没有明确的报道。成年哺乳动物侧脑室的室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回(dentate gyrus,DG)的亚颗粒区(subgranular zone,SGZ)的神经干细胞能分化成神经细胞——成年神经发生,也称为神经再生。海马DG的新生神经细胞与成熟的颗粒细胞具有相同的形态和功能特征,能与海马CA3区的神经元和内嗅皮层的传入纤维建立突触联系,整合入神经网络,替代变性退化的神经元。AD典型的病理学改变包括老年斑沉积、神经元退化和神经纤维缠结。β淀粉肽(β-amyloid peptide,Aβ)是老年斑的主要成分。我们的前期研究已报道了Aβ能刺激海马DG神经干细胞增殖,并损害新生神经元的存活。AD脑的海马神经再生能力被认为是降低的,但是有关神经再生障碍与认知功能减退的相关性报道不多。特别是E2是否参与AD脑海马神经再生过程的调节迄今未见有明确的报道。影像学资料及尸检报告显示抑郁症患者海马体积明显缩小,抗抑郁治疗可促进海马神经再生,增加海马体积,改善抑郁症状。Sigma-1受体(σ1R)作为一个新的抗抑郁药靶点,可促进海马的神经再生。Chevallier等报道,σ1R基因敲除(σ1R-/-)诱导发生抑郁样行为有性别的差异,雄性σ1R-/-小鼠发生抑郁样行为,而雌性σ1R-/-小鼠不发生情感障碍。本课题将使用APP/PS1转基因小鼠(AD模型小鼠)和σ1R-/-小鼠(抑郁模型小鼠)作为工具鼠,重点探讨E2对认知-情感障碍的作用,以及与海马神经再生相关的调控机制,为E2用于女性更年期后AD和抑郁症的治疗提供新的理论依据。研究目的1.探讨E2对卵巢摘除后Aβ损害认知的作用、有效时间窗及其海马神经再生机制。2.明确E2对σ1R敲除小鼠抑郁样行为的影响及其海马神经再生机制。第一部分雌激素对AD小鼠卵巢摘除后认知-海马神经再生障碍的作用及其分子机制材料与方法1.动物模型:(1)AD小鼠模型:5月龄-11月龄的APPswe/PS1d E9转基因(APP/PS1)小鼠,以下简称“AD小鼠”。(2)更年期模型:双侧卵巢摘除(ovariectomy,OVX)。2.E2治疗分组:(1)OVX后早期E2治疗:5月龄OVX后→连续2个月E2治疗;(2)OVX后中期E2治疗:5月龄OVX后→间隔2个月→连续2个月E2治疗;(3)OVX后晚期E2治疗:5月龄OVX后→间隔4个月→连续2个月E2治疗。3.11月龄小鼠进行认知行为检测(Morris水迷宫和Y迷宫)。4.标记海马新生神经细胞:24小时内分三次腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U),24小时后进行Brd U免疫组织化学染色,观察1天龄-Brd U+细胞。5.用免疫染色检测Ki67免疫阳性(Ki67+)细胞数量。6.用酶联免疫(ELISA)的方法检测AD小鼠海马可溶及不可溶的Aβ1-40和1-42(Aβ1-40/42)的水平。7.用Aβ抗体免疫染色观察Aβ的沉积和老年斑。8.蛋白免疫印记(Western Blot)的方法检测海马DG区的p75神经营养因子受体(p75NTR)蛋白水平。9.采用实时定量逆转转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)检查海马DG区p75NTR以及细胞周期蛋白(Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A1)m RNA的水平。结果和小结1.与11月龄野生型(WT)小鼠相比,AD小鼠的认知功能明显减退,主要表现为Y迷宫的进臂交替率下降,水迷宫的登台潜伏期明显延长,撤台后站台象限所占时间减少。OVX-WT小鼠的认知行为与WT小鼠相比并没有明显差异。但是,OVX-AD小鼠的认知功能损害比AD小鼠更为显著——OVX后E2减少能加重AD小鼠的认知损害。2.与溶剂处理的11月龄OVX-AD小鼠相比,OVX后早期E2治疗(请参考实验方法)能明显改善OVX-AD小鼠的认知功能;OVX后中期E2治疗能部分减轻OVX-AD小鼠的认知功能损害;OVX后晚期E2治疗对OVX-AD小鼠的认知障碍没有作用——OVX后早期是E2缓解AD晚期认知障碍的有效时间窗。3.与OVX-AD小鼠相比,OVX后早期,OVX后中期和OVX后晚期E2治疗并没有改变海马区可溶和不可溶的Aβ1-40/42水平、老年斑的形态和数量。4.与WT小鼠相比,7月龄AD小鼠海马1天龄Brd U免疫阳性(Brd U+)细胞和Ki67免疫阳性(Ki67+)细胞数量明显增加,但9月龄AD小鼠海马1天龄Brd U+细胞和Ki67+细胞数量仅有轻微增加——AD早期海马干细胞过增殖;11月龄AD小鼠1天龄Brd U+细胞和Ki67+细胞数量减少约50%——AD晚期海马干细胞增殖能力减退。5.OVX-WT小鼠的海马干细胞增殖能力与WT小鼠相比并没有明显改变。与相应月龄AD小鼠相比,7月龄OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力显著增加,而9月龄OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力增加不明显,11月龄OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力减退更明显——OVX后早期E2减少能刺激AD脑的干细胞过增殖,并进一步加重AD晚期干细胞增殖能力衰退。6.与相应月龄OVX-AD小鼠相比,OVX后早期E2治疗能明显减轻7月龄OVX-AD小鼠海马干细胞过增殖;OVX后中期E2治疗能轻微减少9月龄OVX-AD小鼠的干细胞增殖;OVX后晚期E2治疗对11月龄OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力减退没有作用——OVX后早期E2处理能阻止AD早期的干细胞过增殖。7.与11月龄OVX-AD小鼠相比,OVX后早期E2治疗能缓解OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力减退,OVX后中期E2治疗能部分保护OVX-AD小鼠的干细胞增殖能力,OVX后晚期E2治疗对OVX-AD小鼠干细胞增殖能力减退没有作用——OVX后早期E2处理能缓解AD晚期海马干细胞增殖能力衰退。8.与7月龄WT小鼠相比,OVX-WT小鼠海马p75NTR表达增加,细胞周期因子Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A1的表达没有改变,AD小鼠海马p75NTR表达没有明显改变,但细胞周期因子的表达明显增加;与AD小鼠相比,OVX-AD小鼠海马p75NTR和细胞周期因子的表达都相应增加。E2处理可减少OVX-WT小鼠的p75NTR表达增高,和OVX-AD小鼠p75NTR和细胞周期因子的过表达——Aβ刺激p75NTR活化,E2缺乏增加p75NTR表达。9.7月龄OVX-AD小鼠给予p75NTR抑制剂TAPI-2处理能降低细胞周期因子高表达,并明显抑制OVX-AD小鼠的干细胞过增殖——E2通过抑制p75NTR表达能阻止Aβ刺激细胞增殖。结论OVX后早期E2治疗通过抑制p75NTR表达能减少Aβ增加p75NTR的活性,从而阻止Aβ刺激干细胞增殖,以防止AD晚期海马神经干细胞增殖能力的衰退,减轻认知功能减退。第二部分雌激素对σ1R敲除小鼠抑郁样行为的影响及其海马神经再生机制材料与方法1.动物模型:2月龄Sigma-1受体(σ1R)基因敲除小鼠(简称σ1R-/-小鼠)。2.药物及手术处理:雌鼠双侧卵巢摘除(OVX)或雄鼠连续14天皮下E2处理。Src的抑制剂PP2或Dasatinib,NMDA受体NR2B的拮抗剂Ro25-6981和NMDA受体的激动剂NMDA连续14天腹腔注射。3.情感行为检测:(1)检测在悬尾试验(TST)的不动时间,评价抑郁样行为。(2)检测强迫游泳试验(FST)的不动时间,评价抑郁样行为。4.血清激素水平测定:(1)用酶联免疫吸附实验(ELISA)分析血清的皮质酮水平。(2)用放射免疫测定法(RIA)分析E2和睾酮水平。5.检测海马神经再生:(1)分别在Brd U注射后第7天、14天、21天、28天进行Brd U免疫组织化学染色,检测新生神经元的存活。(2)Brd U和神经特异性核蛋白(Neu N)或胶质纤维酸性蛋白(GFAP)双标记免疫荧光染色检测Brd U+/Neu N+和Brd U+/GFAP+细胞数量。6.用全细胞膜片钳记录,检测海马DG区颗粒细胞的膜特性、NMDA受体介导的电流密度(INMDA)。7.蛋白免疫印记(Western Blot):检测海马DG区NMDA受体NR2B和NR2A亚基以及Src的磷酸化水平。结果和小结1.与WT小鼠相比,σ1R-/-雄鼠表现了抑郁样行为(在悬尾和强迫游泳试验中的不动时间明显延长),而σ1R-/-雌鼠没有明显改变——σ1R缺失诱导抑郁样行为的性别差异。与WT雄/雌鼠相比,σ1R缺失并没有改变血清皮质酮水平,E2和睾酮水平。OVX-σ1R-/-雌鼠发生了抑郁样行为,而E2治疗能明显改善σ1R-/-雄鼠的抑郁样行为——E2能改善σ1R缺失诱导的抑郁样行为。2.与WT小鼠相比,σ1R-/-雄鼠21天龄和28天龄的Brd U+细胞数量明显减少,Brd U+/Neu N+细胞数量减少约30%,Brd U+/GFAP+细胞数量没有改变。而σ1R-/-雌鼠没有显示新生神经细胞数量的改变——σ1R缺失损害海马神经再生的性别差异。OVX-σ1R-/-雌鼠28天龄的Brd U+细胞减少,而E2治疗能增加σ1R-/-雄鼠28天龄的Brd U+细胞——E2能减轻σ1R缺失诱导的海马神经再生损害。3.与WT小鼠相比,σ1R-/-雄鼠海马齿回颗粒细胞INMDA明显减小,NMDA受体NR2B磷酸化水平明显降低。σ1R-/-雌鼠没有显示海马INMDA和NR2B磷酸化水平的改变——σ1R缺失下调NMDA受体有性别差异。OVX-σ1R-/-雌鼠发生INMDA和NR2B磷酸化水平降低。E2治疗能增加σ1R-/-雄鼠INMDA和NR2B磷酸化水平。NMDA受体激动剂能改善σ1R-/-雄鼠的神经再生和抑郁样行为——E2能阻止σ1R缺失诱导的NMDA受体功能降低,保护神经再生,减轻抑郁样行为。4.虽然Src磷酸化水平在WT雄/雌鼠和σ1R-/-雄/雌鼠之间没有明显差异,但是E2治疗能增加σ1R-/-雄鼠的Src磷酸化水平。Src抑制剂PP2或Dasatinib能阻断E2上调σ1R-/-雄鼠的NMDA受体功能、E2的抗抑郁和保护神经再生的作用——E2通过激活Src信号能缓解σ1R缺失诱导NMDA受体功能下调,从而保护神经再生,缓解抑郁样行为。结论E2通过提高Src磷酸化能改善σ1R缺失诱导的NR2B磷酸化降低,从而缓解NMDA受体下调,以保护σ1R敲除小鼠的神经再生和缓解抑郁样行为。