论文部分内容阅读
目的: 血红素加氧酶（Heme Oxygenase,HO）是催化血红素在体内氧化降解的限速酶，现发现有三种同工酶HO-1(Heme Oxygenase-1)、HO-2(Heme Oxygenase-2)、HO-3(Heme Oxygenase-3)，它们均能催化血红素生成CO、胆绿素及铁离子。通常机体在生理状态下表达的是HO-2的生物学活性。HO-2催化血红素降解产生CO等代谢产物。人们注意到CO可以激活鸟苷酸环化酶（sGC）产生环磷酸鸟苷（cGMP）,通过自分泌或旁分泌的形式发挥作用（如扩张血管、抑制血小板聚集等）。因此，有关 HO-2在血管的分布及HO-2/CO扩血管机制的研究日益增加。但这些研究都集中于主动脉、肺动脉、基底动脉等一些大血管，迄今未见HO-2在睾丸动脉定性、定位相关报道。睾丸动脉腔小壁薄，且呈迂曲螺旋状走行于腹股沟管内，血液易在此处形成涡流，承载了较大的压力，也易受到血管活性物质的调节，特别是舒血管物质。鉴于此，本项研究以灵长类动物猴为观察对象，应用细胞培养、免疫组化、MTT分析、流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜观察等方法，自细胞和整体水平观察HO-2在猴睾丸动脉定性、定位、定量表达的加龄变化、HO-2活性抑制剂的抑制作用及探讨HO-2/CO扩张血管的可能机制。 <WP=4>方法1整体水平 采用早期胎猴、中期胎猴、晚期胎猴、生后一周、两岁、四岁不同时期猴，4%多聚甲醛灌流后取出睾丸动脉固定，常规石蜡包埋、切片，用于光镜HE染色、Mason染色及免疫组化研究。2细胞水平 选取健康雄性猴，10%水合氯醛麻醉后无菌状态下取出睾丸动脉，用眼科镊子轻撕去外膜结缔组织，将组织剪成1mm×1mm×1.5mm小块，以10/45cm2块的密度，用加20%小牛血清的DMEM培养，培养60小时血细胞和内皮细胞先游出，移出组织块重新贴壁，静置3天，7-9天后长成单层，15-18天生成致密多层，加0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化液传代至第六代。2.1对培养的睾丸动脉平滑肌细胞进行分组，一组单独培养，一组加入HO抑制剂ZnPP-Ⅸ。MTT法测细胞生长曲线，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标作生长曲线，比较两种细胞的生长情况。2.2取长满单层细胞的玻片，进行HE染色，Giemsa染色、Toluidine blue染色及免疫组化染色。3激光扫描共聚焦显微镜观察 在培养的睾丸动脉平滑肌细胞加入ZnPP-Ⅸ前后Ca2+荧光表达强度。结果1整体水平 1.1 HE染色 睾丸动脉分内膜、中膜、外膜三层。内膜较薄又可见内皮及呈波浪状的内弹性膜；中膜较厚，由十几层环行平滑肌及少量结缔组织构成；外膜与中膜等厚，外弹性膜不明显。1.2 Mason染色：睾丸动脉分内膜、中膜、外膜三层。内膜呈绿色；中膜弹性纤维呈红色，少量的结缔组织呈绿色，外膜呈绿色。1.3 HO-2 免疫组化染色：HO-2<WP=5>呈棕黄色颗粒，主要表达于血管中膜平滑肌层。不同年龄段的HO-2的表达情况如下：早期胎猴、中期胎猴、晚期胎猴睾丸动脉的HO-2表达量较低，随着年龄增加，至生后一周表达量逐渐增多，两岁、四岁时检测到明显的HO-2表达，以四岁时最为明显。其表达结果经统计处理显示：早期胎猴与晚期胎猴、生后一周猴、两岁猴与四岁猴之间的差异有显著性（P<0.01）。中期胎猴与早期胎猴、两岁猴、四岁猴之间差异有显著性（P<0.01）；晚期胎猴与生后一周猴、两岁猴、四岁猴之间差异有显著性（P<0.01）；生后一周猴与早期胎猴、晚期胎猴、四岁猴之间差异有显著性（P<0.01）；两岁猴与早期胎猴、中期胎猴、晚期胎猴、四岁猴之间差异有显著性（P<0.01）；四岁猴与其它各年龄组猴之间差异有显著性（P<0.01）。1.4流式细胞学结果：四岁猴HO-2的表达量最高，依次为四岁猴、两岁猴、生后一周猴、早期胎猴、中期胎猴、晚期胎猴。2细胞水平 2.1平滑肌细胞的生长状况及鉴定 平滑肌细胞静止培养6天后可见细胞从组织块周边呈放射状迁移萌出。2.2 HE染色 平滑肌细胞呈长形、梭形、带状三角形或星形等。胞浆粉红色，核蓝紫色。细胞呈典型的“峰与谷”样生长，血管平滑肌细胞有一卵圆形或圆形明亮的核，核中有1-4个大小不一深色的核仁，细胞浆丰富，含少量颗粒。2.3 Giemsa染色 平滑肌细胞形态同上，核红色，胞浆淡蓝色。2.4 VSMCs细胞生长曲线 单独培养的平滑肌细胞呈倒“S”型生长趋势，第四天达高峰，5天后稳中下降。加入ZnPP-Ⅸ的平滑肌组细胞也呈倒“S”型生长趋势，但曲线整体比单纯平滑肌组低平。2.5 台盼蓝染色结果 共计数1005个细<WP=6>胞，其中203个为阳性，约有90%的细胞染色呈阴性，表明培养细胞传代后存活率高。2.6 HO-2免疫组化结果 单纯培养的平滑肌细胞有较强的HO-2表达，加入ZnPP-Ⅸ后的平滑肌组HO-2的表达减弱。2.7流式细胞学结果 单纯平滑肌细胞组HO-2的表达量高于加入ZnPP-Ⅸ的平滑肌组。3激光扫描共聚焦显微镜观察 单纯睾丸动脉平滑肌细胞培养组，平滑肌细胞内Ca2+荧光表达较弱，加入ZnPP-Ⅸ后的平滑肌组，Ca2+荧光强度表达增强。结论1 免疫组化显示早期胎猴、中期胎猴、晚期胎猴、生后一周猴、两岁猴、四岁猴睾丸动脉中膜平滑肌有HO-2阳性表达，内膜及中膜未见明显的HO-2阳性表达。流式细胞示HO-2表达量量随着年龄的增加增高以四岁猴的睾丸动脉为最高。HO-2表达量的增龄变化可能与肾上腺激素调节有关。