论文部分内容阅读
背景:慈济化癌保生Ⅱ方（Ciji-Hua’ai-Baosheng Ⅱ Formula,CHB）是由慈济化癌保生方精简而来,该方经过多年临床研究,证明其能有效缓解肿瘤患者化疗后胃肠道不适症状,提高患者食欲,增强免疫力,从而提高癌症病患的生存质量。人体肠道微生态的动态平衡调节着整个胃肠道的健康状态,此方在缓解患者胃肠道不适的同时可能也对其胃肠道微生态产生了一定的影响,但该方在肿瘤患者化疗后胃肠道微生态方面是否具有调节作用及其作用机制尚未明确,深入探讨其作用机制可以为肿瘤化疗后患者的临床用药指导提供科学依据。目的:研究CHB对H22肝癌移植瘤化疗后小鼠肠道菌群、肠屏障以及相关因子的调节作用,进一步明确CHB对肿瘤化疗后模式动物胃肠道微生态的影响。研究方法:96只SPF（Specific pathogen-free）级昆明小鼠于右前腋下皮下接种H22肝癌细胞（将肝癌H22细胞悬液调整至2×107/mL）,一周后,小鼠长出肉眼可见移植瘤,一次性腹腔注射 5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）200mg/kg（0.2mL/10g）,建立肝癌 H22荷瘤小鼠化疗后模型。造模成功后,在用药前一天随机抽取36只小鼠,在无菌条件下取小鼠粪便0.2g,并对小鼠实施安乐死处理后,取同一部位的一段回肠组织（>500mg）用于菌群检测。后将剩余60只小鼠按体重、性别分别以随机数字法分为六组（每组10只）:NS-Contr 组（Normal saline control 组,以 0.9%生理盐水 0.2mL/10g 进行每天灌胃1 次）、5-FU-Contr 组（5-Fluorouracilcontrol 组,以 25mg/kg 5-FU 注射液 0.2mL/10g 进行皮下注射,每两天腹腔注射一次5-FU）、YZXJC组（Yangzheng Xiaoji Capsules组,以0.039g/mL养正消积胶囊0.2mL/10g进行每天灌胃1次）及慈济化癌保生Ⅱ号方高剂量（CHB-H）组、中剂量（CHB-M）组、低剂量（CHB-L）组（分别以浓度为3.25g/mL、1.625g/mL、0.8125g/mL的CHB进行每天灌胃1次）。于给药第7天,在无菌条件下收集各组小鼠粪便0.2g备用。并于治疗14天后,禁食12小时,对小鼠实施安乐死后,取样本。在无菌条件下取各组小鼠粪便0.2g,并取小鼠眼球血清、肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺及胃、空肠、回肠、结肠等组织进行相关检测。采用HE（hematoxylin-eosin,HE）染色对肿瘤、肝组织和胃肠组织进行病理分析;采用超高效液质联用法（Ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS）检测 CHB 水煎液中活性成分;采用酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠眼球血清中白细胞介素肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素 22（Interleukin-22,IL-22）、白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素 8（Interleukin-8,IL-8）、白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）、转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）及空肠组织中分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A,SIgA）的含量;采用蛋白印迹法（Western blotting,WB）、免疫组织化学技术法（Immunohistochemistry,IHC）和实时荧光定量-聚合酶链式反应法（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）分别检测结肠组织中核转录因子-KB（Nuclear Factor kappa B,NF-κB）、闭锁小带蛋白-1（Zonula occuluden-1,ZO-1）、紧密连接蛋白Occludin、紧密连接蛋白Claudin-1、黏蛋白-2（Mucin-2,MUC-2）、核转录因子κB抑制蛋白α（I-kappa-B-alpha,IκB-α）的蛋白和基因的表达;采用16S rDNA宏基因测序检测小鼠粪便及回肠中菌群物种构成情况。结果:1.运用UHPLC-MS技术检测出CHB水煎液中含有31种活性成分成分（含3种未知成分）:柚皮甙、橙皮苷、5,7,8,4’-tetramethoxyflavone、川陈皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮、橘皮素、苯丙氨酸、丹参素、protocatechualdehyde、咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、党参苷Ⅰ、党参苷Ⅱ、kukoamine B、木兰花碱、斯皮诺素、烟酸、平贝碱乙、平贝碱甲、平贝碱丙、贝母辛、贝母素甲以及贝母素乙等。2.通过CHB治疗,与NS-Contr组相比,CHB高、中、低剂量组小鼠的体重明显增加,食欲改善,免疫器官功能提高,一般生存状况明显好转。3.CHB高、中、低剂量组内的小鼠血清中的IL-10、TGF-β以及空肠组织中SIgA的蛋白表达量增多;TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-22的蛋白表达量降低;CHB高、中、低剂量治疗组小鼠结肠组织中ZO-1、Occludin、MUC-2蛋白和基因的表达提高;NF-κB、IκB-α蛋白和基因的表达降低。4.在小鼠粪便样本中菌群分析显示,在治疗中期,与NS-Contr组比较,CHB高、中剂量组放线菌门（Actinobacter）、AF12、Adlercreutzia、梭菌属（Clostridium）、红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae）数量明显增多,CHB-M组普雷沃氏菌科（Paraprevotella）数量明显增多。在治疗后期,与NS-Contr组相比较,CHB-H组的脱铁杆菌门（Deferribacteres）、乳杆菌（Lactobacillus）明显增多,Mucispirillum、Odoribacter、RF32 以及 YS2 数量明显减少;CHB-M组乳杆菌明显增多,理研菌科（Rikenellaceae）和YS2数量显著降低。5.在小鼠回肠样本中菌群分析显示,与NS-Contr组相比较,CHB-H组乳杆菌、胃瘤球菌属（Ruminococcus）、拟杆菌（Bacteroides）和 S24-7 明显增多,Mucispirillum 和普雷沃菌属（Prevotella）明显减少。结论:通过CHB治疗,能有效抑制肝癌移植瘤小鼠化疗后肿瘤生长,缓解5-FU化疗后的胃肠道副反应,其机制可能是通过下调NF-κB信号通路,抑制促炎因子的表达,促进抑炎因子的表达,并与相关菌群的变化相互影响,从而减少肠粘膜损伤,增强肠道屏障功能,缓解胃肠道炎症,进而调节肿瘤化疗后小鼠的胃肠道微生态平衡。