【摘 要】
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目的:胰岛素样生长因子（IGFs）是DNA序列与胰岛素非常相似的蛋白质。IGF是细胞用来与周围环境通讯的复杂系统的一部分,它们在促进细胞增殖和抑制细胞死亡或凋亡方面发挥着作用。研究表明,胰岛素/IGF轴在衰老中起着重要作用,在诸如癌症和糖尿病等疾病中也起着重要作用,例如,IGF-1既可以刺激前列腺癌细胞也可以刺激乳腺癌细胞生长。方法:在大肠杆菌中表达与组织纤溶酶原激活剂（TPAST）融合至胰岛素样
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目的:胰岛素样生长因子（IGFs）是DNA序列与胰岛素非常相似的蛋白质。IGF是细胞用来与周围环境通讯的复杂系统的一部分,它们在促进细胞增殖和抑制细胞死亡或凋亡方面发挥着作用。研究表明,胰岛素/IGF轴在衰老中起着重要作用,在诸如癌症和糖尿病等疾病中也起着重要作用,例如,IGF-1既可以刺激前列腺癌细胞也可以刺激乳腺癌细胞生长。方法:在大肠杆菌中表达与组织纤溶酶原激活剂（TPAST）融合至胰岛素样生长因子（IGF1）的重组腺皮质激素（ACTH）重组融合蛋白（His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21）。并使用Ni-NTA琼脂糖珠进行纯化。IGF1通过TPAST底物接头与ACTH融合的原因是因为在血液中存在组织纤溶酶原激活剂（TPAST）,它将作用于TPAST底物接头并切割该部位以释放ACTH和IGF1。IGFI可以使ACTH的效果提高20倍以上。（1）使用Primer Express软件设计wt ACTH,TPAst,IGF1的引物F和R。（2）使用蛋白酶数据库分析了ACTH中的蛋白酶（存在于血液中）的切割位点,并通过重叠PCR方法创建了融合ACTH-IPAst-IGF1的三个基因。（3）接下来,通过使用限制酶消化物连接到p ET21a载体中,构建融合表达质粒（His Tag-Linker-ACTH-TPAST-IGFI-PET21）。（4）将重组质粒转化到大肠杆菌BL21-DE3菌株中进行蛋白表达。（5）在分析ACTH-TPAst-IGF1融合的重组蛋白的表达是否在上清液或沉淀级分中后,使用Ni-NTA琼脂糖珠进一步纯化。（6）由于蛋白质在大肠杆菌的沉淀级分中表达,因此由于形成包涵体而使其变性和微粒化。因此,需要对其进行复性和溶解以使其重折叠以增加活性。（7）下一步是在基于体外细胞的测定和体内测定中测试该蛋白的功能。结果:（1）通过重叠PCR产生融合的基因产物,然后亚克隆到p ET21a载体中。（2）构建野生型（WT）ACTH-TPAST-IGFI的质粒,然后通过DNA测序进行验证:（3）从大肠杆菌菌株BL21-DE3中表达并纯化以上所有物质。在SDS-PAGE凝胶上进行了考马斯亮蓝染色,显示了14kd融合蛋白在IPTG诱导培养物的沉淀级分和蛋白质纯化级分后的洗脱级分中的表达。（4）但是,由于蛋白质不溶,因此将其透析并重新折叠并浓缩蛋白质。（1）分子实验结果1.质粒图谱2.双重酶促裂解3.将融合基因PCR产物克隆到载体中4.DNA测序5.重组融合蛋白在大肠杆菌中的表达6.蛋白质纯化和洗脱蛋白的复性。7.SDS-PAGE。凝胶用可可蓝染色。8.ELISA法测定小鼠中c AMP,CREB和Gluco皮质类固醇浓度的产生（由于Covid-19的当前情况,有待完成）结论:（1）我们成功地在大肠杆菌中以沉淀级分克隆并表达了重组融合蛋白。（2）使用Ni-NTA磁珠对该14KD蛋白进行蛋白纯化得到纯洗脱级分,纯蛋白浓度为＿（3）我们成功地通过透析使14kd融合蛋白的蛋白复性。
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