论文部分内容阅读
目的:由于休眠体的存在和配子体导致的无症状传播,间日疟原虫已成为疟疾消除的重要障碍之一。全球50%以上的间日疟原虫感染负担发生在东南亚地区,特别是大湄公河次区域(the Greater Mekong Subregion,GMS),中缅边境就是受威胁地区之一,该地区也是我国输入性疟疾的重要来源。自2014年以来,GMS的疟疾下降率开始停滞不前甚至出现逆转趋势。为了改变这种现状,各国开始着重开发传播阻断疫苗(Transmission-blocking vaccines,TBVs)。TBVs以疟原虫的有性阶段为目标,且TBVs候选抗原的多态性十分有限,这为开发广泛有效的疟疾疫苗带来了可能。配子体是疟原虫从宿主感染按蚊的唯一发育阶段,因此配子体表面蛋白是重要的TBVs候选抗原。P48/45和P47均是配子体表面蛋白,其中P48/45对雄配子的受精发挥不可或缺的作用,而P47不仅在雌配子的优化受精中发挥重要作用,还能够协助疟原虫逃避当地蚊媒的免疫系统。在确定了抗原功能的基础之上,研究编码基因的遗传多样性是开发疫苗的重要内容之一。然而,近几年在中缅边境缺乏对Pvs48/45多样性的研究;且在中缅边境尚未进行过Pvs47的研究。因此,本文分析了来自中缅边境间日疟原虫分离株Pvs48/45和Pvs47的遗传特点,以探索其能否作为该地区有价值的传播阻断疫苗候选抗原。方法:使用滤纸血DNA提取试剂盒提取127例来自中缅边境疟疾流行区的间日疟原虫基因组DNA(gDNA);采用巢式PCR(nest-PCR)扩增Pvs48/45和Pvs47基因的开放阅读区(Open reading frame,ORF)并完成测序;通过MEGA 7.0和DnaSP v5.10对Pvs48/45和Pvs47的基因多样性和自然选择特点进行分析;使用DnaSP v5.10检测Pvs48/45和Pvs47在中缅边境地区的连锁不平衡和重组;使用DnaSP v5.10和STRUCTURE v2.3.4评估Pvs48/45和Pvs47在中缅边境地区和全球已报道的其他地区之间的地理分化;使用PHYLOVIZ 2.0探索Pvs48/45和Pvs47在全球的单倍型分布。结果:1.在Pvs48/45序列中检测到9个突变位点,其中7个为非同义突变,分别是E35K,H211N,K250N,T273S,D335Y,A376T,K418R;2个为同义突变,分别是K89K和F352F。在Pvs47序列中发现了16个突变位点,包括14个非同义突变(F6V,F22L,F24L,K27E,S57T,S62N,L82V,V230I,M233I,F237I,I262K,I262T,I273V,A373V)和2个同义突变(T26T,F356F)。2.Pvs48/45序列中9个突变位点导致了9种单倍型,单倍型多样性为0.796;核苷酸多态性水平极低,仅为0.00094,其中CRDⅢ区的最高,为0.00265。在Pvs47序列中发现了24种单倍型,单倍型多样性为0.875;核苷酸多态性为0.00183,其中CRDⅢ区呈现出比其他两个区更高的多态性(π=0.00179)。3.在Pvs48/45基因中,种内和种间中性检验均没有统计学意义。在种内检验中,除CRDⅡ区以外,结果几乎均大于零,尤其是CRDⅢ区达到了较高的值。MK检验显示中立性指数(Neutrality index,NI)大于零,表明了同义突变在物种之间的累积。在Pvs47基因中,ORF区的Tajima’D为0.071,Fu&Li的D*和F*值分别为-0.413和-0.286;CRDⅠ区中性检验结果均为负值;CRDⅡ区和CRDⅢ区几乎均为正值。MK检验在Pvs47的ORF区和CRDⅠ区呈现显著正的NI值,分别为P<0.01和P<0.05。Z-检验显示Pvs47的ORF区和CRDⅡ区为显著的正选择。4.Pvs48/45和Pvs47基因在中缅边境地区的最小重组参数分别为2和3,重组参数C分别为1.718,2275和0.046,60.1。连锁不平衡指数Zns和Za均没有统计学意义。5.种群分化显示Pvs48/45在全球的Fst范围为0.00-0.83,Pvs47为0.07-0.98;种群结构显示Pvs48/45在全球范围内形成4个结构集群,Pvs47形成3个。6.全球单倍型网络图显示Pvs48/45在全球共有23个单倍型,其中H5为最主要的单倍型;Pvs47在全球共形成42个单倍型,H21为最主要的单倍型。Pvs48/45和Pvs47单倍型均具有较为明显的大洲聚集性。结论:1.Pvs48/45和Pvs47在中缅边境的多样性水平极低,且Pvs48/45的CRDⅢ区以及Pvs47的CRDⅡ区和CRDⅢ区呈现正选择趋势,提示可作为传播阻断疫苗候选抗原。2.Pvs48/45和Pvs47基因重组水平很低,且不存在显著的连锁不平衡,可能为造成低水平基因多样性的主要原因。3.Pvs48/45和Pvs47在全球具有很强的地理分化,单倍型的分布也具有地理聚集性和多样性,提示应根据各大洲主要单倍型特点开发更加有针对性的传播阻断疫苗。