论文部分内容阅读
目的本论文主要从中药材制巴戟天（Morinda officinalis）中提取粗多糖,并对其粗多糖进行分离和纯化,获得多糖组分和均一多糖成分。同时研究其理化性质及体内和体外的抗肝损伤活性和免疫活性。方法本论文采用60℃和100℃对制巴戟天药材进行连续水提、醇沉、溶解、透析和冷冻干燥的方法获得二种粗多糖（MOP-60和MOP-60-100）,也采用100℃水煎、醇沉、溶解、透析和冷冻干燥的方法获得一种粗多糖（MOP-100）。采用DEAE-纤维素和Sephadex G-100柱层析的方法对粗多糖MOP-60和MOP-60-100分别进行化学分离和纯化,获得多糖组分和多糖成分。采用苯酚-硫酸法测定糖含量,间羟联苯法测定糖醛酸含量,高效凝胶过滤色谱法测定多糖分子量分布或分子量,毛细管电泳法测定单糖组成。同时采用红外光谱法和核磁共振法对多糖成分进行化学结构表征。建立刀豆蛋白（Con A）诱导的免疫性肝损伤小鼠模型,评价制巴戟天粗多糖体内抗肝损伤作用;采用人L-O2肝细胞体外评价多糖对肝细胞增殖和抗Con A或H2O2诱导损伤的活性;采用人Hep G2.2.15肝癌细胞体外评价多糖对肝细胞分泌HBs Ag和HBe Ag的抑制作用;采用小鼠原代脾淋巴细胞体外评价多糖对脾细胞增殖和分泌细胞因子的影响。结果1.制巴戟天药材粉末在100℃条件下水煎,经醇沉、透析和冷冻干燥后,获得粗多糖MOP-100,得率为4.75%,糖含量为49.4%,其含有峰高分子量为6.1×104Da的多糖以及低分子寡糖。制巴戟天药材粉末在60℃条件下提取二次,经醇沉、透析和冷冻干燥后,获得粗多糖MOP-60,得率为4.02%,糖含量为89.7%,其主要含有峰高分子量为2.1 k Da的寡糖。60℃提取后的残渣再100℃煎煮、醇沉、复溶和冷冻干燥后,获得粗多糖MOP-60-100,得率为0.19%,糖含量为41.3%,其含有峰高分子量为6.4×104Da的多糖以及寡糖。2.粗多糖MOP-60经过DEAE-纤维素柱层析,获得多糖组分MOP-60-A和MOP-60-B二个多糖组分。MOP-60-A主要含有峰高分子量为2.1 k Da的寡糖;MOP-60-B主要含有峰高分子量为6.3×104Da的多糖以及寡糖。粗多糖MOP-60-100经过DEAE-纤维素柱层析,获得三个多糖组分MOP-60-100-A、MOP-60-100-B和MOP-60-100-C。MOP-60-100-A主要含有峰高分子量为1.1 k Da的寡糖;MOP-60-100-B主要含有峰高分子量为6.4×104Da的多糖以及寡糖;MOP-60-100-C主要含有峰高分子量为5.8×104Da、1.3×104Da的多糖以及寡糖。3.多糖组分MOP-60-A经过1000 Da膜透析分离,获得多糖成分MOP-60-I。MOP-60-I为白色粉末,其峰高分子量为2.3 k Da,单糖组成摩尔比为果糖:葡萄糖=10.19:1。多糖组分MOP-60-100-B经过Sephadex G-100柱层析分离和纯化,最终获得多糖成分MOP-60-100-I和MOP-60-100-II。MOP-60-100-I为白色粉末,其峰高分子量为6.3×104Da,单糖组成摩尔比为阿拉伯糖:葡萄糖:鼠李糖:半乳糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=3.31:0.02:0.19:1.00:0.06:0.11。MOP-60-100-II为淡黄色粉末,峰高分子量为7.8 k Da,单糖组成摩尔比为木糖:阿拉伯糖:葡萄糖:鼠李糖:岩藻糖:半乳糖:甘露糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸=0.07:1.07:0.44:0.66:0.07:1.00:0.04:0.16:1.84。4.粗多糖MOP-100对Con A诱导的免疫性肝损伤小鼠具有一定的保护作用,能够降低小鼠的死亡率,减轻Con A引发的肝脏炎症损伤、氧化损伤和免疫损伤。5.粗多糖MOP-100、MOP-60、MOP-60-100、多糖组分MOP-60-B、MOP-60-100-B、MOP-60-100-C和多糖亚组分MOP-60-100-B-b均能够体外促进人L-O2肝细胞的增殖,抑制Con A引起的细胞凋亡或死亡。6.粗多糖MOP-60-100、多糖组分MOP-60-100-C和多糖成分MOP-60-I体外对H2O2诱导的的人L-O2肝细胞死亡有明显抑制作用。7.粗多糖MOP-100对Hep G2.2.15肝细胞分泌HBe Ag有明显抑制作用,但对分泌HBs Ag的抑制作用不明显。8.粗多糖MOP-60、MOP-60-100能够促进Balb/C小鼠原代脾细胞增殖。多糖组分MOP-60-A和MOP-60-100-A与Con A诱导的T细胞增殖和LPS诱导B细胞增殖均有拮抗作用;多糖组分MOP-60-B和MOP-60-100-B与LPS诱导B细胞增殖有拮抗作用;多糖组分MOP-60-100-C在250μg/m L剂量下能够促进脾细胞增殖,与LPS诱导B细胞增殖有协同作用,但与Con A诱导的T细胞增殖有拮抗作用。9.多糖组分MOP-60-100-A、MOP-60-100-B对Balb/C小鼠原代脾细胞分泌IFN-γ有抑制作用,MOP-60-100-C在250μg/m L剂量下对小鼠脾细胞分泌IFN-γ和腹腔巨噬细胞分泌TNF-α有促进作用。结论本论文从制巴戟天中提取得到三种粗多糖（MOP-60、MOP-60-100和MOP-100）,对其进行系统化学分离,获得五种多糖组分（MOP-60-A、MOP-60-B、MOP-60-100-A、MOP-60-100-B和MOP-60-100-C）,对多糖组分进行分离和纯化,最终获得三个均一多糖（MOP-60-I、MOP-60-100-I和MOP-60-100-II）,并多糖的理化性质进行了初步表征。同时建立了体内外模型评价制巴戟天多糖的抗肝损伤和免疫调节作用,发现不同的制巴戟天多糖具有明显的抗肝损伤和免疫调节活性。