【摘 要】
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N~6-甲基腺嘌呤（N~6-methyladenine,6m A）是原核生物中最常见的DNA修饰,在DNA复制、转录和细胞防御系统等生物学过程中发挥着重要作用。随着表观遗传修饰检测技术的发展,真核生物中也发现了6m A的存在。研究表明,6m A可能是一种潜在的表观遗传标志物。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）是一种常见的模式生物,已被证明其体内存在6m
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N~6-甲基腺嘌呤（N~6-methyladenine,6m A）是原核生物中最常见的DNA修饰,在DNA复制、转录和细胞防御系统等生物学过程中发挥着重要作用。随着表观遗传修饰检测技术的发展,真核生物中也发现了6m A的存在。研究表明,6m A可能是一种潜在的表观遗传标志物。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）是一种常见的模式生物,已被证明其体内存在6m A修饰。线虫全基因组的结构图谱以及基因组中6m A位点分布已被绘制出,但是关于线虫体内6m A相关的结合蛋白研究较少。为了进一步了解真核生物体内6m A修饰的结合蛋白及其生物学功能,本课题以秀丽隐杆线虫为研究对象,通过二甲基定量蛋白质分析的方法鉴定出线虫体内6m A结合蛋白Cey-1,并对其关于线虫表型以及转录的影响进行研究。本论文主要从以下几个方面开展:（1）定量蛋白质组学通过同位素标记的方法对复杂体系的所有蛋白质进行鉴定和定量。我们选择定量蛋白质组学的稳定同位素二甲基标记策略结合DNA下拉分析实验,对线虫体内6m A修饰的潜在结合蛋白进行鉴定。我们利用含有6m A修饰的双链DNA探针在体外筛选潜在的结合蛋白。通过重/轻标甲醛在酶解后的肽段上形成同位素标记,并利用这种质量差异进行生物质谱的检测与分析。最终筛选出6m A修饰探针的潜在结合蛋白Cey-1,为6m A修饰在线虫体内的生物学效应研究提供了值得借鉴的思路。（2）Cey-1是含有保守性冷休克结构域的Cey家族蛋白,目前有研究表明Cey家族蛋白对核糖体的形成有影响。为了进一步验证Cey-1与6m A之间的关系,我们构建了含Flag-tag的Cey-1重组质粒作为真核表达载体,将质粒转染于293T细胞中,进行融合蛋白的真核表达。通过蛋白免疫印记实验证明Cey-1在细胞内存在超表达。接下来,我们将DNA下拉实验与蛋白免疫印迹实验相结合,体外验证表明,Cey-1可与含6m A修饰的DNA直接结合。该结果为真核生物体内6m A结合蛋白的研究提供了重要的理论依据。（3）我们进一步探究了Cey-1在线虫中的潜在生物学功能。利用线虫RNAi技术,我们成功构建Cey-1缺陷型秀丽隐杆线虫突变体。通过对野生型以及Cey-1缺陷型突变体的线虫子代数目进行统计,探究Cey-1对线虫繁殖存活的影响。同时,我们构建了Cey-1参与的体外转录体系,通过二代测序技术统计分析转录产物序列的频率以及碱基突变率,表明Cey-1不会对6m A介导的体外转录体系的效率和转录保真性产生影响。本研究拓宽了我们对Cey-1的生物学作用机制的认识。综上所述,本论文利用二甲基定量蛋白质分析方法结合体外下拉实验,通过生物质谱鉴定出了线虫体内6m A潜在结合蛋白Cey-1,体外验证进一步表明Cey-1蛋白可与6m A直接结合。Cey-1缺陷型线虫数目统计实验说明线虫体内Cey-1基因的敲低并不会对线虫繁殖存活造成影响。通过对转录产物序列的频率以及碱基突变率进行分析,在正常生理条件下,Cey-1不会对6m A介导的体外转录的效率和保真性产生影响,但是在线粒体应激反应下,Cey-1可能以另一种途径参与跨代遗传的调控过程。
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