一、背景与目的食管鳞癌是我国食管癌最常见的病理类型之一,因其发病率和死亡率较高而有“中国癌症”之称。尽管食管鳞癌起病部位均位于狭长的食管粘膜,病理类型也相对单一,但其临床表现和预后却大相径庭,这可能与食管鳞癌的癌变过程中多种癌基因扩增、激活以及抑癌基因突变、缺失等复杂的基因表达调控网络紊乱密切相关。因此深入了解食管鳞癌细胞增殖、侵袭转移的分子机制,筛选预测肿瘤生物学行为的关键分子标志,是临床食管鳞癌个体化诊断和治疗的重要研究方向。MicroRNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA,可在转录后水平负向调控靶基因表达,从而广泛参与细胞分化、增殖和凋亡等过程,调控肿瘤的生长和转移。本研究旨在探讨miRNA在食管鳞癌发生发展过程中的调控作用。利用体内、体外等模型及临床组织标本,从细胞的增殖、侵袭和转移等方面探讨miR-143-3p在食管鳞癌发生发展中的作用,及其相关分子机制,为临床食管鳞癌的诊治寻找新的预测指标和治疗靶点。二、材料、方法和结果第一部分人食管鳞癌组织和细胞中差异表达的miRNA分子的筛选实验方法1、采用高通量miRNA基因芯片技术对5对食管鳞癌和其对应的癌旁组织进行miRNA差异表达谱筛选;2、选定miR-143-3p,miR-133b,miR-143-5p为研究对象,在食管正常上皮细胞（HEEC）和食管鳞癌细胞株（Kyse30,Kyse70,Eca109,Ec9706）中利用 real time RT-PCR法检测其表达水平;3、选定miR-143-3p作为进一步研究对象,利用收集的80例临床食管鳞癌及相应癌旁组织标本,运用real time RT-PCR法验证组织中miR-143-3p表达水平;4、结合上述80例患者的临床病理资料,分析miR-143-3p表达水平与临床病理特征和预后的关系。结果1、通过高通量miRNA基因芯片技术,我们在食管鳞癌和相应的癌旁组织标本中筛选出差异表达倍数≥50的miRNA共有28条,其中癌组织中上调的miRNA有21条,下调的miRNA有7条。2、进一步选取下调≥100倍的miR-143-3p,miR-133b和miR-143-5p这3个miRNA,并利用RT-PCR进行验证,在4株食管鳞癌细胞株中,miR-143-3p下调最为明显,与芯片结果一致。3、与癌旁组织相比,miR-143-3p在80例食管鳞癌组织中表达显著下调（p<0.01）。4、在食管鳞癌临床组织标本中,miR-143-3p的表达水平与患者TNM分期（p=0.026）和淋巴结转移（p=0.038）呈显著负相关;采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现,miR-143-3p低表达者临床总生存期明显缩短;Cox风险比例回归模型显示,miR-143-3p的低表达与食管鳞癌患者不良预后相关,可作为临床判断食管鳞癌预后的一个独立危险因素。第二部分 MiR-143-3p对人食管鳞癌细胞生物学特性的影响实验方法1、通过构建miR-143-3p基因过表达载体（miR-143-3p）和干涉载体（anti-miR-143-3p）及相应对照载体,转染至ESCC细胞中,并利用嘌呤霉素（Puromycin,PM）筛选出稳转细胞,通过MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验等分析miR-143-3p表达水平的变化对ESCC细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响;2、收集扩增培养后的上述稳转细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后测量移植瘤的长短径,绘制肿瘤生长曲线,2-3周后处死裸鼠,并将剥离的肿瘤瘤组织进行TUNEL染色,分析miR-143-3p表达水平的变化对ESCC细胞体内增殖、凋亡的影响。结果1、miR-143-3p的过表达可抑制ESCC细胞增殖,促进其凋亡,同时能抑制细胞迁移和转移;相反,抑制miR-143-3p表达,可促进ESCC细胞增殖、抑制其凋亡,并可增强细胞体外迁移和侵袭能力;2、建立裸鼠皮下移植瘤模型,结果发现,miR-143-3p过表达组移植瘤的体积和重量较对照组显著降低,且存在统计学差异。肿瘤组织TUNEL染色结果提示miR-143-3p组肿瘤细胞凋亡水平较对照组显著增高,证实miR-143-3p可在体内抑制肿瘤的生长。第三部分MiR-143-3p靶基因预测及功能验证实验方法1、利用四个不同的miRNA靶基因在线分析软件TargetScan Human 6.0（http://www.targetscan.org）、microRNA.org（http://www.microma.org）、PITA（http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07data.html）和PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）,在线预测分析miR-143-3p可能结合的靶基因。2、选定QKI作为miR-143-3p的候选靶基因,利用real time RT-PCR法检测食管癌细胞株中QKI mRNA的表达水平;3、收集80例临床食管鳞癌及癌旁组织,运用real time RT-PCR法和IHC法检测临床组织标本中QKI mRNA和QKI蛋白的表达水平,并分析QKI与miR-143-3p表达水平之间的关系;4、利用荧光素酶报告基因实验进一步证实QKI为miR-143-3p直接调控的靶基因;5、通过人为改变ESCC细胞中miR-143-3p的表达水平,利用real time RT-PCR方法检测QKI各分子亚型QKI-5,QKI-6以及QKI-7的表达变化;6、构建QKI-5基因的过表达（pLenti QKI-5）、干涉（pLenti siQKI-5）载体及相应的对照载体并转染至ESCC细胞,通过puromycin抗生素筛选出稳定转染的细胞系,运用MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,分析QKI-5对ESCC细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的影响;7、收集扩增培养后上述稳定转染的细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后测量移植瘤的长短径,绘制肿瘤生长曲线,2-3周后处死裸鼠并将剥离的瘤组织进行TUNEL染色,分析QKI-5表达水平对ESCC细胞体内增殖、凋亡的影响。结果1、运用4个miRNA靶基因在线预测软件分析,QKI mRNA3’-非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）存在 miR-143-3p 的潜在结合位点,提示 QKI 是miR-143-3p的候选靶基因;2、在ESCC细胞株中,QKI mRNA的表达水平较正常食管上皮细胞显著上调;3、与癌旁组织相比,临床80例食管鳞癌组织中,QKI的mRNA和蛋白水平表达均明显上调,并且QKI mRNA的表达水平与miR-143-3p表达水平呈负相关。4、荧光素酶报告基因结果显示,QKI是miR-143-3p直接调控的靶基因;5、上调miR-143-3p表达后,ESCC细胞中QKI-5 mRNA下调最为显著;相反地,下调miR-143-3p表达后,QKI-5 mRNA上调最为显著,提示miR-143-3p通过靶向调控QKI-5参与调控肿瘤生长;6、在ESCC细胞中,抑制QKI-5表达可抑制其增殖,促进其凋亡,抑制细胞迁移和侵袭;相反,过表达QKI-5基因后,可促进ESCC细胞增殖、抑制细胞凋亡,并可增强细胞迁移和侵袭能力;7、利用上述稳定转染细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,pLenti siQKI-5组移植瘤的体积明显小于对照组,TUNEL结果显示该组细胞凋亡水平明显高于对照组;相反,过表达QKI-5后,与对照组相比,移植瘤的肿瘤体积明显增大,且该组细胞凋亡水平低于对照组,上述结果提示QKI-5可在体内促进肿瘤的生长。第四部分MiR-143-3p调控ESCC细胞增殖、侵袭转移的机制研究实验方法1、将过表达QKI-5的pLenti QKI-5载体以及对照pLenti-Blank分别转染至稳定过表达miR-143-3p的ESCC细胞中,运用MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,分析ESCC细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的差异;2、收集扩增培养后上述稳定转染的细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后测量移植瘤的长短径,绘制肿瘤生长曲线,并将剥离的瘤组织进行TUNEL染色,分析各组细胞体内增殖和凋亡的差异;3、运用Western blot和IHC法检测miR-143-3p和QKI-5表达改变后ESCC细胞中EMT分子标志物表达水平的变化。结果1、在稳定过表达miR-143-3p的细胞株中恢复QKI-5表达,可部分逆转miR-143-3p介导的抑制细胞增长,促进细胞凋亡的能力,并可部分恢复ESCC细胞迁移和侵袭的能力;2、在裸鼠皮下移植瘤模型中,恢复QKI-5表达后,肿瘤的生长速度较miR-143-3p组显著上调,且肿瘤组织的自然凋亡率也明显下调;3、在ESCC细胞中,上调miR-143-3p表达水平,可诱导细胞中上皮分子标记表达上调、间质分子标记表达下调;类似的,下调QKI-5表达后,亦可诱导细胞上皮分子标记表达上调,间质分子标记表达下调;然而,恢复过表达miR-143-3p细胞中QKI-5表达水平,则可削弱miR-143-3p抑制ESCC细胞上皮间质转化的能力。三、结论与意义1、MiR-143-3p在食管鳞癌细胞和组织中显著下调,且miR-143-3p表达水平与食管鳞癌患者TNM分期（p=0.026）和淋巴结转移（p=0.038）呈显著负相关,并与患者的临床预后密切相关。2、MiR-143-3p可抑制食管鳞癌细胞增殖、促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,逆转EMT过程。3、QKI是miR-143-3p直接调控的靶基因,在肿瘤细胞和组织中呈高表达,并且其表达水平与miR-143-3p表达呈负相关。4、QKI的分子亚型QKI-5,在体内可促进食管鳞癌细胞增殖、抑制细胞凋亡,促进细胞迁移和侵袭,诱导EMT转化,并可部分逆转miR-143-3p抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭的作用。本研究筛选出食管鳞癌及癌旁组织miRNA的差异表达谱,并以miR-143-3p为重点研究对象,分析miR-143-3p在人食管鳞癌中的表达水平及其与临床预后的关系,验证了miR-143-3p通过靶向QKI-5调控食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用,并且这一作用可能与上皮间质转化有关。本研究揭示了 miR-143-3p在食管鳞癌发生发展中的作用,为食管鳞癌的诊断和治疗提供了新的分子靶点和预测指标。