目的：　　采用自发性非肥胖2型糖尿病GK大鼠，研究GK大鼠的血液生化指标、骨代谢和骨骼肌的特点。应用丹参素、骨化三醇和二甲双胍药物对其进行干预，通过采用糖耐量试验、micro-CT、骨组织二维形态计量学、实验性骨生物力学、免疫组化、Realtime PCR等方法观察丹参素、骨化三醇和二甲双胍对2型糖尿病GK大鼠血糖、骨组织和肌肉组织的影响，并分别探讨其作用机理。为阐明2型糖尿病导致的骨组织与肌肉病变的机制和丹参素、骨化三醇和二甲双胍防治2型糖尿病性骨质疏松（T2DOP）和2型糖尿病性肌病（T2DMP）的可能性提供实验依据。　　方法：　　采用34只10周龄雄性 GK大鼠(由上海斯莱克实验动物有限公司提供),平均体重为289.34±19.76g，和周龄、性别匹配的健康Wistar大鼠16只作为正常对照组,平均体重为258.00±9.95g。全部大鼠给予常规饲料喂养，每两周进行一次糖耐量实验和体重称量。参照上海斯莱克实验动物有限公司关于GK大鼠的实验研究，在糖耐量实验中，空腹血糖（0h血糖）有两次以上大于等于7.0mmol/l，或者2血糖大于11.1mmol/l，即可诊断为糖尿病。本实验GK大鼠在13周龄时均诊断为糖尿病。将34只13周龄GK大鼠和16只13周龄Wistar大鼠分别随机选取8只大鼠进行活体micro-CT扫描其胫骨近端，直至18周龄GK大鼠出现骨量丢失后进行药物干预。在21周龄时，将34只GK大鼠随机分为4组，分别为糖尿病模型组(GK)、丹参素组(GK+Tan)、骨化三醇组(GK+Cal)和二甲双胍组（GK+Met）。糖尿病模型组，上午给予蒸馏水5ml/kg/d；丹参素组，上午给予丹参素溶液25mg/kg/d；骨化三醇组，上午给予骨化三醇混悬液0.045ug/kg/d；二甲双胍组，上午给予二甲双胍溶液200mg/kg/d，共给药20周。正常对照组和糖尿病模型组大鼠在喂养至13、18、23、28、32和38周龄，用micro-CT观察活体大鼠胫骨骨微结构和骨密度。在药物干预后第11周和第16周（即分别是32 周龄和38周龄大鼠）,将对丹参素组、骨化三醇组和二甲双胍组大鼠其胫骨进行micro-CT活体扫描。　　于药物干预后第20周（即41周龄大鼠）实验结束，在实验结束前第3,4，13和14天，分别给全部大鼠皮下注射钙黄绿素（10mg/kg）进行体内荧光标记。实验结束当天，用3%戊巴比妥0.17ml/100g进行腹腔注射麻醉大鼠，用剪刀打开大鼠的胸腔，暴露心脏，右心室取血处死。分离血清，检测血脂、血糖、血钙、血磷、血清胰岛素、血清糖化蛋白、氧化指标、骨代谢相关指标，分离肝脏、胰腺、肾、肾上腺、比目鱼肌和腓肠肌，观察大体形态并称取湿重；取大鼠右侧胫骨上段、右侧胫骨中段和第五腰椎进行甲基炳烯酸甲脂包埋以制备不脱骨切片，应用半自动图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。用Lloyd LR5K Plus骨生物力学检测系统分析大鼠左侧股骨生物力学性能；取大鼠胰腺固定后作常规石蜡包埋，HE染色，将染色组织切片置于Nikon显微镜下观察和拍照组织形态改变；右侧股骨脱钙、石蜡包埋、制片后用免疫组化化学染色检测TXNIP蛋白的表达；取部分腓肠肌，进行固定和石蜡包埋，HE染色，将染色组织切片置于Nikon显微镜下观察和拍照组织形态改变；另外一部分腓肠肌，用 Real-Time PCR（RT-PCR）技术，检测肌肉组织泛素系统的mRNA表达。右股骨进行免疫组化染色检测TXNIP蛋白的表达。实验数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。　　结果：　　1.体重变化：与Wistar组比较，12周龄GK大鼠体重增加9.7%（P<0.05，274.40±10.65 Vs303.89±15.80）；随周龄的增加，14~40周龄期间Wistar组体重增速明显大于GK大鼠，20~40周龄期间GK大鼠体重略有增长但几近停滞，明显低于同期Wistar组（P<0.05）。　　2.糖耐量试验（Oral Glucose Tolerance Test, OGTT）结果：在空腹血糖（OGTT0h）结果中，与同期Wistar组比较，12~40周龄GK大鼠血糖均升高（P<0.05），12~22周龄GK组OGTT0h血糖高于7.0mmol/l,而24~40周龄GK组OGTT0h血糖低于于7.0mmol/l；在OGTT1h血糖结果中，与同期Wistar组比较，12~40周龄 GK组血糖均升高（P<0.05），16~40周龄的 GK组 OGTT1h血糖高达15.0mmol/l;在OGTT2h血糖结果中,与同期Wistar组比较，12~40周龄GK大鼠血糖均升高（P<0.05），22~40周龄的GK大鼠OGTT2h血糖维持在11.1mmol/l 以上。　　3. GK大鼠在不同周龄时的骨微结构和骨密度变化：在13~40周龄期间， GK组胫骨近端松质骨骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁连接密度（Conn-D）有一定缓慢上升后下降的过程。与同期Wistar组相比，13周龄GK组胫骨近端松质骨BV/TV、Conn-D较为接近，差异无统计学意义（P>0.05），但是13周龄 GK组 Tb.N下降（P<0.05），18~38周龄 GK组胫骨近端松质骨BV/TV、Tb.N、Conn-D均下降（P<0.05）。在13~40周龄期间，GK组胫骨近端松质骨骨密度（BMD）进行性下降，其中，与同期Wistar组相比,13周龄GK组胫骨近端松质骨 BMD较为接近，差异无统计学意义（P>0.05），18~38周龄GK组胫骨近端松质骨BMD均下降（P<0.05）。在13~40周龄期间，GK组胫骨近端松质骨骨小梁分离度（Tb.Sp）的变化趋势并不大，但是，与同期Wistar组相比，GK组胫骨近端松质骨Tb.Sp均增加（P<0.05）。与同期Wistar组相比，13周龄GK组胫骨近端松质骨骨小梁厚度（Tb.Th）较为接近，差异无统计学意义（P>0.05），18~38周龄GK组胫骨近端松质骨Tb.Th均下降（P<0.05）。　　4.各药物组对GK大鼠体重与肌肉湿重的变化作用：在药物干预20周过程里，与 GK组比较，GK+Tan组、GK+Cal组和 GK+Met组体重无显著性差别（P>0.05），但是GK+Tan组体重几乎没有变化趋势，而GK+Cal组体重在药物干预的第16周开始有增长趋势，GK+Met组体重则在药物干预的第10周开始就开始有增长趋势了；在实验结束后，与Wistar组相比，GK组的腓肠肌湿重减轻（P<0.05），与GK组相比，GK+Tan组、GK+Cal组和GK+Met组的腓肠肌湿重均不同程度增加，但没有显著性差别（P>0.05）。　　5.各药物组对GK大鼠OGTT血糖的作用：在GK+Tan组中发现，丹参素药物在干预第0~20周过程中，与同期GK组比较，GK+Tan组OGTT0h血糖稍微降低，但无统计学意义（P>0.05）；在干预早期，GK+Tan组OGTT1h血糖有较大的降低趋势，在第6、8周，与GK组相比，GK+Tan组OGTT1h血糖均降低（P<0.05），但是在干预后期，GK+Tan组OGTT1h血糖下降趋势不大；在第0~18周时，与GK组相比，GK+Tan组OGTT2h血糖有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05），但是在第20周，GK+Tan组OGTT2h血糖降低（P<0.05）。　　在GK+Cal组中发现，骨化三醇药物在干预的第14周，与GK组相比，GK+Cal 组 OGTT Oh血糖降低（P<0.05），但在第16~20周中，GK+Cal组OGTT Oh血糖有下降趋势，但是无统计学意义（P>0.05）；在第12~20周时，与GK组相比， GK+Cal组OGTT1h血糖有下降趋势，其中在第16、18周时，GK+Cal组OGTT1h血糖降低（P<0.05）；在第12、16和20周时，与GK组相比，GK+Cal组OGTT2h血糖降低（P<0.05）。　　在GK+Met组发现，二甲双胍药物在干预的第12、14、16、20周时，与GK组相比，GK+Met组OGTT Oh血糖均降低（P<0.05）；在干预第0~20周时，与GK组相比，GK+Met组OGTT1h血糖有下降趋势，其中在药物干预第12~20周时，GK+Met组OGTT1h血糖降低（P<0.05）；在第4、6、12、14、16、18和20周时，与GK组相比，GK+Met组OGTT2h血糖降低（P<0.05）。　　6.各药物组对2型糖尿病GK大鼠血清生化指标的结果，与Wistar组比较， GK组的骨形成指标骨钙素（OCN）降低（P<0.05），碱性磷酸酶（AKP）的血清水平升高（P<0.05），骨吸收指标I型胶原C端肽（CTX-I）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的血清水平升高（P<0.05）。与 GK组比较，GK+Tan组 OCN、AKP、CTX-I和TRAP血清水平无统计意义，GK+Cal组AKP和CTX-I血清水平降低（P<0.05），GK+Met组AKP、CTX-I和TRAP血清水平降低（P<0.05）。　　与Wistar组比较，GK组血钙（Ca）水平无统计学差异（P>0.05），GK组血磷（P）水平下降（P<0.05）。与GK组比较，GK+Tan和GK+Met组血Ca、P水平均无统计学差异（P>0.05），但GK+Cal组血P水平升高（P<0.05）。　　与 Wistar组比较，GK组血脂总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C)和低密度脂蛋白（LDL-C)水平有统计学意义（P<0.05)，与GK组相比，GK+Tan和 GK+Cal组血脂 CHO、TG、HDL-C水平无统计学差异（P>0.05），GK+Met组血脂CHO水平下降（P<0.05）, GK+Cal和GK+Met组血脂LDL-C均升高（P<0.05)。　　与Wistar组比较，GK组血清抗氧化指标超氧化物歧化酶（SOD)水平降低（P<0.05)；与 GK组相比，各组药物干预组血清 SOD水平并无统计学差异（P>0.05）。与 Wistar组相比，GK大鼠血清氧化指标丙二醛（MDA)水平升高（p<0.05)；与GK组相比，GK+Tan、GK+Cal组血清MDA水平有下降趋势，但无统计学意义（P>0.05），GK+Met组血清MDA水平降低（P<0.05)。　　与 Wistar组相比，GK组血清胰岛素（INS)、果糖胺（GSP)水平升高（P<0.05)；与GK组相比，GK+Tan组血清INS、GSP水平无统计学差异（P>0.05）， GK+Cal组血清INS水平有升高趋势但无统计学差异（P>0.05），GK+Cal组血清GSP水平下降（P<0.05)，GK+Met组血清INS、GSP水平均下降（P<0.05)。　　7.各药物组对GK大鼠胫骨近端micro-CT三维形态计量学结果：micro-CT结果显示，在GK+Tan组中发现，在丹参素药物干预了11周后，与GK组比较， GK+Tan组胫骨近端松质骨骨微结构和骨密度稍有改善，但无统计学意义（P>0.05）；在干预了16周后，GK+Tan组胫骨近端松质骨骨微结构和骨密度稍有改善，但无统计学意义（P>0.05）。　　在GK+Cal组中发现，在骨化三醇药物干预了11周后，与GK组比较，GK+Cal组胫骨近端松质骨BV/TV、Conn-D、Tb.N、Tb.Th和BMD增加（P<0.05）；在干预了16周后，GK+Cal组胫骨近端松质骨Tb.Th和BMD增加（P<0.05）；　　在 GK+Met组中发现，在二甲双胍药物干预了11周后，与 GK组比较， GK+Met组胫骨近端松质骨BV/TV、Conn-D、Tb.N、Tb.Th和BMD增加（P<0.05）；在干预了16周后，GK+Met组胫骨近端松质骨 BV/TV、Conn-D和 BMD增加（P<0.05）。　　8.各药物组对2型糖尿病 GK大鼠股骨骨生物力学指标的结果显示，与Wistar组相比，GK组股骨骨生物力学性能最大载荷（Maximum load）、弹性载荷（Elastic load）、断裂载荷（Fracture load）和刚度（Stiffness）依次下降18.5%（P<0.05)、15.6%（P<0.05)、17.1%（P<0.05)和12.3%（P<0.05)。　　与GK组比较，GK+Tan组Maximum load、Elastic load和Fracture load无统计学差异（P>0.05），但Stiffness增加（P<0.05)，GK+Cal组Maximum load、Elastic load、Fracture load和Stiffness依次增加14.1%（P<0.05)、12.7%（P<0.05)、16.4%（P<0.05)和11.9%（P<0.05)；GK+Met组Maximum load、Elastic load、Fracture load和Stiffness依次增加14.5%（P<0.05)、9.7%（P<0.05)、14.0%（P<0.05)和11.3%（P<0.05)。　　9.各药物组对2型糖尿病 GK大鼠骨组织形态计量学变化的结果显示，静态参数：与Wistar组相比，GK组胫骨近端松质骨骨小梁面积分数（%Tb.Ar）、Tb.Th和Tb.N均减少（P<0.05)，骨小梁分离度（Tb.Sp）增加（P<0.05)；GK组胫骨中段皮质骨面积（Ct.Ar）和皮质骨面积分数（%Ct.Ar）均减少（P<0.05)，骨髓面积分数（%Ma.Ar）增加（P<0.05)；GK腰椎松质骨%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N均减少（P<0.05)，Tb.Sp增加（P<0.05)。　　与GK组大鼠相比，GK+Tan组大鼠胫骨近端松质骨%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N均无统计学差异（P>0.05），但是Tb.Sp减少（P<0.05）；GK+Cal组%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N均增加（P<0.05），Tb.Sp减少（P<0.05)；GK+Met组%Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N均增加（P<0.05），Tb.Sp减少（P<0.05)。与 GK组大鼠相比，GK+Tan、GK+Cal和GK+Met组大鼠胫骨中段Ct.Ar、%Ct.Ar和%Ma.Ar均无统计学差异（P>0.05）。与 GK组大鼠相比，GK+Tan组腰椎松质骨%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N均无统计学差异（P>0.05）；GK+Cal组腰椎松质骨%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N增加（P<0.05），Tb.Sp减少（P<0.05）；GK+Met组腰椎松质骨%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N增加（P<0.05），Tb.Sp减少（P<0.05)。　　动态参数：与Wistar组相比，GK组胫骨近端松质骨荧光周长分数（%L.Pm）、骨矿化沉积率(MAR）、骨形成率/组织参数(BFR/TV）、骨表面新骨形成率(BFR/BS）、骨转换率(BFR/BV）和成骨细胞表面占骨小梁表面的百分比（%Ob.S/BS）均减少（P<0.05），破骨细胞表面占骨小梁表面的百分比（%Oc.S/BS）增加，但无统计学差异（P>0.05）；GK组胫骨中段皮质骨骨内膜荧光周长百分数（%E-L.Pm）、骨外膜荧光周长百分数（%P-L.Pm）、骨外膜动态参数骨矿化沉积率(P-MAR)、骨外膜骨形成率(P-BFR/BS)均减少（P<0.05）；GK组腰椎松质骨%L.Pm、MAR、BFR/TV、BFR/BS、BFR/BV和%Ob.S/BS均减少（P<0.05），%Oc.S/BS增加（P<0.05）。　　与GK组相比，GK+Tan组胫骨近端松质骨%L.Pm、MAR、BFR/TV、BFR/BS和BFR/BV均无统计学差异（P>0.05）；GK+Cal和GK+Met组%L.Pm、MAR、BFR/TV、BFR/BS和BFR/BV均增加（P<0.05），与GK组比较，GK+Tan组的%Ob.S/BS和%Oc.S/BS均无统计学差异（P>0.05），GK+Cal和 GK+Met组的%Ob.S/BS均增加（P<0.05），但它们的%Oc.S/BS均无统计学差异（P>0.05）。与GK组大鼠相比，GK+Tan组胫骨中段皮质骨%E-L.Pm、%P-L.Pm、P-MAR和P-BFR/BS均无统计学差异（P>0.05）；GK+Cal和GK+Met组%E-L.Pm、%P-L.Pm、P-MAR和P-BFR/BS均增加（P<0.05）。与GK组相比，GK+Tan组腰椎%L.Pm、MAR、BFR/TV、BFR/BS和 BFR/BV均无统计学差异（P>0.05），GK+Tan组腰椎%Ob.S/BS和%Oc.S/BS均无统计学差异（P>0.05），GK+Cal和 GK+Met组%L.Pm、MAR、BFR/TV、BFR/BS、BFR/BV和%Ob.S/BS均增加（P<0.05），%Oc.S/BS无统计学差异（P>0.05）。　　10.各药物组对2型糖尿病GK大鼠股骨TXNIP蛋白表达的结果，与Wistar组相比，GK组股骨组织中TXNIP蛋白表达明显增加(P<0.05）。与GK组相比， GK+Tan组股骨组织中TXNIP蛋白表达有降低趋势，但无统计学意义（P>0.05）， GK+Cal和GK+Met组股骨组织中TXNIP蛋白表达明显下降（P<0.05）。　　11.各药物组对2型糖尿病GK大鼠腓肠肌病理结构结果的结果，Wistar组骨骼肌细胞分布正常，肌束排列紧密，细胞膜清晰，肌细胞面积多。GK组骨骼肌细胞排列稀疏，肌细胞出现不同程度萎缩退行性改变，肌细胞面积减少。与GK组相比，GK+Tan组腓肠肌细胞排列较紧密，肌细胞面积稍增多，但是肌细胞分布不均一。与GK组相比，GK+Cal组肌细胞分布较均一，排列紧密，肌细胞面积增多。与GK组相比，GK+Met组肌细胞排列紧密，面积增多，无出现度萎缩退行性改变。　　12.各药物组对2型糖尿病GK大鼠肌肉泛素化系统的结果，与Wistar组相比，GK组肌肉组织泛素化系统mRNA表达增加（P<0.05）。与GK组比较，GK+Tan组肌肉组织泛素化系统mRNA表达有增加趋势，但无统计意义（P>0.05），GK+Met组和GK+Cal组表达增加（P<0.05）。　　13.各药物组对2型糖尿病GK大鼠胰腺病理结构的结果显示，Wistar组胰岛为椭圆形细胞团，边界清晰，形态规则，胰岛内细胞数目较多、排列整齐、分布均匀，胰岛细胞质丰富、核圆、较多，未见异常。GK组胰岛体积变小，与周围组织边界模糊不清，形态不规则，胰岛内细胞数量减少、排列稀疏，并可见空泡变性。与GK组相比，GK+Tan组胰岛形态并没有改善，同样出现胰岛细胞萎缩等明显的病理性改变。与GK组相比， GK+Cal组胰岛形态有所改善，但也存在胰岛体积变少，形态不规则，与周围组织界限较模型组有所清晰，并且胰岛内细胞有所增加。GK+Met组胰岛形态稍不规则，但与周边组织界限较清晰，胰岛细胞排列基本整齐、数目增多，细胞形态较好，无明显坏死。　　结论：　　1.2型糖尿病GK大鼠呈现空腹高血糖、糖耐量受损和胰岛素抵抗，并伴血脂代谢紊乱，GK大鼠是一种较好的2型糖尿病动物模型。　　2.2型糖尿病GK大鼠无明显肥胖，体重增长缓慢，可排除肥胖对骨代谢的影响，可作为研究和观察2型糖尿病骨代谢紊乱的理想动物模型。　　3.2型糖尿病GK大鼠早期松质骨骨密度明显下降，骨微结构发生退变，在13~38周龄期间，随年龄增长，骨量逐渐下降，骨微结构受损程度加重，GK大鼠在41周龄时，其骨生物力学强度降低，伴随腓肠肌湿重下降，腓肠肌病理结构受损，并通过肌肉组织泛素化系统mRNA表达增加进而引起GK大鼠肌肉萎缩和病变。　　4.2型糖尿病GK大鼠不仅出现血清骨转换代谢指标异常，成骨细胞活性下降，破骨细胞代谢活跃，并且可出现明显的骨组织形态计量学动态和静态参数异常，骨小梁数目减少，骨小梁结构受损，骨矿化沉积下降。成骨细胞功能障碍可能是2型糖尿病GK大鼠骨代谢失衡的主要机制，但是破骨细胞活性增强也是参与其中的主要因素。其中，2型糖尿病GK大鼠可能通过增加 TXNIP蛋白在骨组织中的表达来影响骨代谢。　　5.骨化三醇可能通过增加体内活性维生素D3水平来改善胰岛素抵抗和降低GK大鼠血糖，二甲双胍和骨化三醇能使GK大鼠的骨量增加，骨微结构改善，使成骨细胞活性增强，破骨细胞活性减弱，促进骨形成，抑制骨吸收，并可能通过降低TXNIP蛋白在骨组织中的表达来促进骨形成，另外，也可能通过降低2型糖尿病GK大鼠泛素化系统mRNA表达来抵抗肌肉组织受损。其中，骨化三醇主要由于　　6.在25mg/kg/d丹参素剂量药物的干预早期，有一定降低GK大鼠的血糖的作用，但是在干预后期，由于没有对GK大鼠的胰腺起到保护作用，丹参素该降糖作用减弱。该剂量的丹参素对2型糖尿病GK大鼠的骨量、骨微结构和肌肉变化无明显作用。