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微小隐孢子虫是一种重要的人兽共患肠道寄生原虫,宿主范围广泛,是世界范围内导致人和动物腹泻性疾病的主要病原之一。由微小隐孢子虫引起的隐孢子虫病通常以自限性为特征,但对于免疫低下的人群则可发展为慢性和致死性的腹泻。目前,关于微小隐孢子虫与宿主细胞相互作用的分子机制以及涉及疾病病理过程的机制尚不清楚。因此,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学的方法,分别对微小隐孢子虫与HCT-8细胞相互作用过程中的分泌蛋白及HCT-8细胞膜蛋白进行定量和生物信息学分析。根据组学分析结果,筛选出3个入侵相关基因进行重组表达,并探究了其在微小隐孢子虫入侵HCT-8细胞过程中相关生物学功能,以期为研究隐孢子虫入侵宿主细胞机制和抗隐孢子虫疫苗的筛选奠定理论基础。（1）C.parvum卵囊纯化与子孢子制备。隐孢子虫脱囊释放子孢子被认为是衡量卵囊活力和感染性的重要指标,从卵囊中分离纯化出子孢子也是隐孢子虫体外研究中的基础和关键环节。本研究采用单密度蔗糖离心法和氯化铯（Cs Cl）法相结合对传代卵囊进行纯化,共得到了7.2×1010个卵囊。通过对比4种实验室常用的卵囊脱囊方法,最终确定了方法4为最佳卵囊体外脱囊释放子孢子的方案。利用Percoll密度梯度离心法对C.parvum子孢子进行纯化,纯化得到的子孢子纯净单一。基于PCR和Time-course方法,确定了C.parvum子孢子在感染HCT-8细胞0-3 h时处于滑行运动状态,而在3.5-6 h时处于粘附/入侵状态。（2）C.parvum感染HCT-8细胞分泌蛋白组学研究。C.parvum子孢子在宿主细胞表面进行滑行运动期间,会分泌一些蛋白帮助其粘附/入侵宿主细胞。目前,关于隐孢子虫子孢子粘附/入侵宿主细胞过程中的分泌蛋白组成并不完全清楚。本研究在对C.parvum子孢子感染HCT-8细胞过程中分泌蛋白组进行解析的同时,运用TMT标记定量蛋白质组学技术,对隐孢子虫子孢子滑行运动状态时（3 hpi）和粘附/入侵HCT-8状态时（6 hpi）的分泌蛋白组进行比较及生物信息学分析。鉴定到了一些可能在虫体与宿主细胞互作过程中的重要分子,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及入侵机制的研究提供了基础数据。对C.parvum差异表达分泌蛋白功能进行了生物信息学分析发现,C.parvum含CAP结构域蛋白在子孢子处于滑行运动时表达量较高,对这些蛋白结构和功能的进一步研究可能为开发抗隐孢子虫病药物靶标和疫苗筛选提供新的思路。（3）C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学研究。隐孢子虫在入侵宿主细胞过程中,与细胞膜上一系列受体蛋白相结合,进而引起细胞膜表面受体蛋白以及介导信号通路相关蛋白发生变化来发挥相关生物学功能。目前,还未有关于C.parvum感染HCT-8细胞膜蛋白组学的相关研究的报道。本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对微小隐孢子虫感染和未感染HCT-8细胞膜蛋白质组进行比较分析,以1.5倍为差异表达变化的阈值,共鉴定到714个差异表达蛋白,其中上调蛋白625个,下调蛋白116个。通过对差异表达蛋白以及部分膜蛋白进行功能分析发现,C.parvum的感染主要参与了对HCT-8细胞屏障功能的破坏,以及引起宿主细胞骨架蛋白的改变;整合素（integrins）可能作为受体蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中具有重要作用。相关HCT-8细胞膜蛋白的鉴定与功能分析,为C.parvum与宿主细胞互作机制相关研究奠定了理论基础。（4）Cp Trap/Cp Crisp/Cp Carp蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能研究。本研究通过对C.parvum含CAP结构域蛋白进行功能分析,并对Cp Crisp、Cp Carp以及含TSP结构域的Cp Trap等三个蛋白进行了原核表达和多克隆抗体制备。从基因表达模式、内生发育阶段蛋白定位及体外中和特性等方面探究了Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能。q RT-PCR结果显示,Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp在检测时间过程中（0-72 h）均有表达,且在72 hpi时达到最大值。免疫荧光结果显示,Cp Trap蛋白定位在卵囊腔内和子孢子膜表面;Cp Crisp蛋白定位在卵囊腔内、子孢子中后部及裂殖子胞质中,而Cp Carp则定位在卵囊腔内,子孢子和裂殖子胞质中。与对照组相比,抗Cp Trap/Cp Crisp/Cpcarp多克隆抗体分别对C.parvum入侵HCT-8细胞都具有一定的阻断作用。综上所述,本研究首次运用TMT标记定量蛋白质组学方法,对C.parvum与HCT-8细胞互作过程中的分泌蛋白组和HCT-8细胞膜蛋白组进行鉴定和定量分析。通过对差异表达蛋白的生物信息学分析,为C.parvum入侵关键功能基因的筛选及研究C.parvum与宿主细胞互作机制奠定理论基础。此外,对Cp Trap、Cp Crisp和Cp Carp三个蛋白在C.parvum入侵HCT-8细胞过程中的生物学功能进行了探究,并证实其可作为抗隐孢子虫疫苗的候选靶标。