【摘 要】
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新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）作为呼吸道新发病原体,可引起人新型冠状病毒肺炎,具有较高的传染性和一定的致死率。新型冠状病毒肺炎引发的疫情对全球公众健康构成了严重威胁,目前迫切需要安全有效的疫苗来实现群体免疫,预防和控制SARS-CoV-2进一步传播。DNA疫苗可同时诱导细胞和体液免疫应答,具有成本
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新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）作为呼吸道新发病原体,可引起人新型冠状病毒肺炎,具有较高的传染性和一定的致死率。新型冠状病毒肺炎引发的疫情对全球公众健康构成了严重威胁,目前迫切需要安全有效的疫苗来实现群体免疫,预防和控制SARS-CoV-2进一步传播。DNA疫苗可同时诱导细胞和体液免疫应答,具有成本低、操作简单等优点。针对SARS-CoV-2刺突蛋白（spike protein,S蛋白）和RBD蛋白的中和抗体可阻断RBD蛋白与其受体结合,从而防止病毒侵入,是SARS-CoV-2疫苗设计的理想靶点。本研究拟针对SARS-CoV-2主要保护性抗原RBD蛋白及多表位抗原基因,构建2种SARS-CoV-2重组DNA候选疫苗,通过小鼠免疫试验评价2种疫苗的免疫效果。RBD重组蛋白多克隆抗体制备:为验证2种SARS-CoV-2 DNA候选疫苗的体外表达,以重组RBD蛋白作为免疫原,与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,制备针对RBD蛋白的多克隆抗体。3免4天后收集血清,使用新型冠状病毒小鼠ELISA检测试剂盒对小鼠血清进行抗体效价测定,结果表明针对RBD重组蛋白的特异性IgG抗体效价可达1:409600以上。经Western Blot验证表明,制备的RBD重组蛋白多克隆抗体可与RBD重组蛋白发生特异性结合,且条带单一,大小正确。SARS-CoV-2重组DNA候选疫苗构建及鉴定:获取已报道的SARS-CoV-2 S、N、M和E蛋白的部分T、B细胞表位,将表位之间加入接头序列（Linker）进行串联,获得表位串联体基因,命名为EPI;加入Linker,与RBD基因进行串联获得RBD-EPI基因。针对人密码子偏好性,对RBD和RBD-EPI基因进行优化与合成,连接pVAX1载体后成功构建pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI 2种重组质粒。使用制备的重组RBD蛋白多克隆抗体作为一抗,将pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI 2种重组质粒转染BHK-21细胞,进行体外表达验证。通过Western Blot验证表明,pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI 2种重组质粒在体外均得到很好的表达,且条带单一,大小正确。SARS-CoV-2重组DNA候选疫苗小鼠免疫评价:为评估pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI 2种DNA疫苗的免疫效果,将2种DNA疫苗联合PIKCA佐剂免疫BALB/c小鼠,同时设定pVAX-RBD-EPI单独免疫组、pVAX1联合PIKCA和PBS对照组。3免后14天,pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI联合PIKCA佐剂免疫组,针对SARS-CoV-2 RBD蛋白的特异性IgG抗体平均效价可达为1:17200和1:14933,pVAX-RBD联合PIKCA佐剂免疫组针对SARS-CoV-2假病毒的中和抗体平均效价可达1:75;pVAX-RBD-EPI单独免疫组、pVAX1联合PIKCA和PBS对照组均未检测到特异性抗体和中和抗体。结果表明2种DNA疫苗联合PIKCA佐剂免疫小鼠后,可产生很好的体液免疫反应,PIKCA佐剂对2种DNA疫苗均有明显的免疫增强效果。胞内细胞因子检测结果表明,2种DNA疫苗联合PIKCA佐剂免疫小鼠后产生的CD3+CD8+IFN-γ表达水平分别是PBS对照组的2.70倍和3.31倍,与对照组PBS相比,差异均显著;胞内细胞因子CD3+CD4+IFN-γ、CD3+CD8+IL-4和CD3+CD8+IL-4的表达与对照组相比,有一定升高,差异不显著。结果表明,2种DNA疫苗联合PIKCA佐剂免疫小鼠后,可产生细胞免疫反应,主要诱导针对SARS-CoV-2的Th1型特异性CD8+T细胞免疫反应。综上所述,本研究成功构建pVAX-RBD和pVAX-RBD-EPI 2种DNA候选疫苗,2种DNA候选疫苗联合PIKCA佐剂免疫小鼠后可产生很好的体液和细胞免疫效果。本研究结果为SARS-CoV-2疫苗的进一步研究提供技术参考。
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