论文部分内容阅读
研究背景:弗里德赖希共济失调(Friedreich ataxia,FRDA)是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病。该病的发病年龄常在儿童早期,病程呈进程性发展,多在40到50岁死亡。FRDA病人的主要临床症状表现为脊柱侧弯、中枢神经系统衰退、深感觉丧失、肌肉虚弱无力和心肌肥大。FRDA的主要发病机制是人类第9号染色体上frataxin(FXN)基因的第一个内含子中存在GAA序列的大量重复扩增,导致FXN蛋白表达减少。而FXN蛋白是参与铁硫簇合成的重要分子,线粒体中许多酶需要铁硫簇作为辅基发挥活性。因此,FXN蛋白表达减少将会影响细胞内铁硫簇的合成和铁稳态,进而引起线粒体功能障碍和氧化应激的发生,最终导致FRDA的发生。目前为止,尚未发现有效治疗FRDA疾病的药物,一些旨在改善线粒体功能和提高FXN表达的治疗方法仍在探究中。SS-31是Szeto和Schiller研究发现的一类线粒体靶向的化合物,具有很好的抗氧化作用。SS-31能够靶向聚集在线粒体内膜上,促进电子传递,增加ATP的合成,并减少活性氧(ROS)的产生。研究表明,SS-31在线粒体功能失调和氧化应激的疾病模型中具有很好的保护作用。目的:在本研究中我们以FRDA病人来源的淋巴细胞系GM15850为研究对象,以正常人淋巴细胞系GM15849,GM14519作为对照,旨在研究SS-31是否能够改善病人细胞线粒体的功能及其作用机制,进而明确其是否具有治疗FRDA的潜在应用价值。具体研究内容主要有:(1)明确SS-31对FXN表达的影响。(2)检测线粒体功能指标,明确SS-31是否能够改善病人细胞线粒体的功能。(3)检测含有铁硫簇的酶的活性,研究SS-31对病人细胞铁硫簇合成的影响。(4)检测病人细胞中铁代谢相关蛋白的表达,研究SS-31对病人细胞铁代谢的影响。(5)研究SS-31对病人细胞ROS的水平及清除和抵抗ROS能力的影响。(6)检测SS-31对FXN转录和翻译水平的影响,确定SS-31上调FXN表达的机制。方法:1)用不同浓度SS-31处理FRDA病人淋巴细胞,通过Western blotting检测Frataxin的蛋白水平,筛选出合适的用药浓度和处理时间。2)测定SS-31处理后的病人细胞中MMP,ATP,NADH/NAD+及线粒体拷贝数,电镜下观察线粒体形态。3)测定SS-31处理后的病人细胞中顺乌头酸酶,电子传递链,黄嘌呤氧化酶的活性。4)Western blotting检测健康人细胞,FRDA病人细胞以及SS-31处理后的病人细胞中铁调节蛋白2(IRP2),转铁蛋白受体1(TfR1)和铁蛋白(ferritin)的表达,用荧光探针检测细胞中可利用的铁水平。5)流式细胞术检测健康人、病人细胞及SS-31处理后的病人细胞中ROS的水平,超氧化物歧化酶,过氧化氢酶活性和蛋白水平,以及用CCK8检测细胞对过氧化氢的抵抗能力。6)实时定量PCR检测FXN的mRNA水平,SILAC检测新合成的FXN的水平。结果:(1)SS-31处理提高了 FXN的表达水平。(2)SS-31处理改善了病人细胞的线粒体膜电位,提高了 ATP的含量,并且使病人细胞NADH/NAD+比值下降,保护了线粒体内膜结构,说明SS-31改善了病人细胞线粒体的质量。荧光定量PCR结果显示SS-31增加了病人细胞中线粒体的数目。(3)SS-31处理提高了病人细胞中线粒体顺乌头酸酶,电子传递链复合物Ⅱ,Ⅲ的活性,对黄嘌呤氧化酶XOD的活性没有影响。(4)SS-31处理提高了病人细胞中IRP2,TfR1和ferritin的蛋白水平,增加了病人细胞线粒体中可利用的铁水平。(5)病人细胞中ROS水平明显高于正常人细胞,SS-31处理减少了病人细胞中ROS含量,增强病人细胞抵抗氧化应激的能力。(6)SS-31对FXN的mRNA水平没有影响,显著增加了新合成的FXN,从翻译水平上调FXN的表达。结论:SS-31在翻译水平上调了 FXN的表达,改善了 FRDA病人细胞的线粒体功能,增强FRDA病人细胞抗氧化应激能力;SS-31有望成为治疗FRDA的潜在药物。