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背景与目的:肿瘤的发生进展与肿瘤细胞的侵袭能力密切相关,恶性胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤,肿瘤细胞的浸润性扩散侵袭能力是造成恶性胶质瘤不良预后的主要原因之一。叉头框转录因子基因家族(FOX家族)对促进肿瘤的侵袭、迁移能力起到至关重要的作用,叉头框转录因子(Forkhead box C1,FOXC1)是FOX家族中重要的的一个成员,而FOXC1作为FOX家族中的一员在多种恶性肿瘤的侵袭及进展中的作用尤为重要。近年来相关研究表明FOXC1通过促进上皮间质转化从而使肿瘤的侵袭、迁移能力增强,引起肿瘤恶性特质程度的升高,不利于预后。目前还没有相关文章报道FOXC1在对胶质瘤增强的侵袭能力中发挥的作用,具体的调控机制仍然还不清楚,亟待深入探索。β-catenin作为Wnt信号通路中的关键蛋白可以诱导肿瘤细胞发生EMT,调控肿瘤细胞的侵袭。泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-βroteasome system,UPS)作为细胞内蛋白降解的主要途径,对肿瘤细胞中蛋白水平的调控至关重要。蛋白降解过程中蛋白先被泛素标记,然后被蛋白酶体识别从而导致蛋白降解、表达量在细胞中的降低。本实验通过临床样本分析、体外基础功能实验,研究FOXC1对胶质瘤的侵袭能力影响机制发现FOXC1通过去泛素化酶USP4影响泛素-蛋白酶体途径抑制β-catenin蛋白降解从而稳定β-catenin蛋白水平的表达,增强肿瘤细胞的侵袭能力造成恶性胶质瘤不良预后。这些研究揭示了 FOXC1在促进肿瘤侵袭能力方面的特殊生物学作用,为FOXC1/USP4/[β-catenin作为胶质瘤诊断及治疗的靶点提供了理论依据,并为日后阻断胶质瘤的侵袭提供了一个新的潜在治疗方法。研究方法:1.qRT-PCR、Western blotting实验检测正常脑组织与胶质母细胞瘤组织样本中FOXC1的mRNA和蛋白表达水平;根据胶质瘤病理分级,qRT-PCR、Western blotting检测正常脑组织样本与胶质瘤I、II、III、IV级别组织样本中FOXC1的mRNA水平和蛋白水平;在胶质瘤细胞系U87、U251、T98G、LN229、U118、HS683中与正常星形胶质细胞对比FOXC1的mRNA、蛋白表达水平。2.将 FOXC1-siRNA 转染至 U87 和 U251 细胞中分别 qRT-PCR、Western blotting检测转染效率;细胞划痕损伤修复实验、体外Transwell实验检测敲低FOXC1表达水平后侵袭、迁移生物学能力的改变;Western blotting实验检测在细胞系转染FOXC1-siRNA后EMT相关标记蛋白表达水平变化情况。3.U87 和 U251 细胞系中转染 FOXC1-siRNA,Western blotting 检测与 EMT诱导发生相关转录因子β-catenin蛋白水平。4.在U87细胞系敲低FOXC1表达量及设置FOXC1-siRNA、FOXC1-siRNA并过表达β-catenin分组,分别细胞划痕损伤修复实验、体外Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的变化情况;并通过Western blotting检测EMT相关标记蛋白表达5.胶质瘤细胞系转染FOXC1-siRNA后,RT-PCR和qRT-PCR检测β-catenin的mRNA改变情况;在U87和U251细胞系中加入蛋白合成抑制剂环己酰亚胺处理后,提取蛋白,Western blotting检测敲低FOXC1对β-catenin蛋白稳定性的影响。6.在 U87 和 U251 细胞系转染 FOXC1-siRNA,Western blotting 检测加入MG 132处理后对β-catenin蛋白表达的影响;Western blotting检测FOXC1-siRNA转然后对β-catenin蛋白泛素化途径降解的影响。7.在U87和U251细胞、293T细胞中探寻FOXC1如何通过USP4影响β-catenin蛋白泛素化途径降解研究结果:1.与正常脑组织相比,胶质母细胞瘤组织样本中FOXC1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高;随着胶质瘤病理分级级别的升高,FOXC1的mRNA 水平和蛋白水平也逐渐升高;胶质瘤细胞系U87、U251、T98G、LN229、U118、HS683中FOXC1的mRNA和蛋白表达水平与正常星形胶质细胞对比明显升高。2.U87和U251细胞中转染FOXC1-siRNA后,FOXC1mRNA和蛋白表达敲低效率显著;细胞划痕损伤修复实验、体外Transwell实验发现敲低FOXC1表达水平后U87和U251细胞系侵袭、迁移能力明显减弱;转染FOXC1-siRNA后EMT相关标记蛋白中上皮相关标记蛋白E-cadherin明显升高、间质相关标记蛋白N-cadherin和Vimentin表达水平明显降低。3.U87和U251细胞系中下调FOXC1表达后,与EMT发生相关转录因子ββ-catenin蛋白水平相应下调明显。4.细胞划痕损伤修复实验、体外Transwell实验发现过表达β-catenin并不能逆转下调FOXC1表达后对细胞侵袭能力的抑制。5.U87和U251细胞系转染FOXC1-siRNA后,细胞中β-catenin的mRNA表达水平无任何改变,而只对β-catenin的蛋白水平产生下调作用;下调FOXC1后会导致β-catenin蛋白稳定性减弱,蛋白降解的半衰期显著加快,引起β-catenin的蛋白水平下降。6.MG132处理转染FOXC1-siRNA后的U87和U251细胞系可以逆转下调FOXC1对β-catenin蛋白下调的影响;FOXC1表达下调后通过加速蛋白泛素化途径加快β-catenin蛋白降解。7.FOXC1通过影响去泛素化酶USP4的表达量改变β-catenin泛素化程度,调节β-catenin蛋白表达水平。研究结论:1.FOXC1在人脑胶质母细胞瘤中与正常脑组织相比表达明显升高,切随着胶质瘤表达级别升高而升高。2.FOXC1通过直接上调β-catenin的表达调控人脑胶质瘤细胞的侵袭和迁移。3.FOXC1通过泛素-蛋白酶体系统影响β-catenin蛋白的降解从而调控β-catenin蛋白表达。4.FOXC1通过去泛素化酶USP4调节β-catenin的蛋白稳定