背景及目的作为人体一个重要且复杂的内分泌器官,肾上腺由两种不同胚胎来源的组织组成:中胚层衍生的、产生皮质类固醇的肾上腺皮质和外胚层衍生的,产生儿茶酚胺的肾上腺髓质。成人的肾上腺皮层由三个在组织学和功能上不同的结构组成:最外层的球状带（zona glomerulosa z G）,中间的束状带（zona fasciculata z F）和内层的网状带（zona reticularis z R）。肾上腺髓质中的嗜铬细胞主要是分泌应激相关的激素产物:肾上腺素和去甲肾上腺素。人体内环境的稳态依赖于应对各种生理和病理变化做出反应和适应的能力。人体这种独特能力主要是由下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic–pituitary–adrenal HPA）轴和交感神经-肾上腺髓质系统组成的“压力应激系统”来协调。在重症感染的患者中,由于下丘脑和垂体因炎症受损,调节肾上腺皮质激素分泌的两个主要激素:促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素的水平都受到抑制。然而,这些患者的糖皮质激素水平却能够保持正常甚至升高,提示机体的应激反应从中枢的垂体依赖性调节机制到局部的垂体非依赖调节机制的过渡转变。此过程可能涉及的诸多机制中,肾上腺内环境的激活起着关键作用。作为机体应激系统的主要效应器官,肾上腺内存在一个重要的微环境。在此微环境中,免疫系统-肾上腺皮质,免疫系统-肾上腺髓质、肾上腺皮质-髓质细胞之间的相互作用和肾上腺的高度血管化的器官特征发挥着关键作用。在炎症应激阶段,肾上腺激素的合成分泌调节主要是由激活肾上腺内微环境这种垂体非依赖性机制介导的,越来越多的实验研究支持肾上腺微环境中的不同类型细胞在维持内环境稳态过程中的关键作用。在生理和病理状况下,微环境中包括肾上腺皮质细胞,髓质细胞,免疫细胞等多种不同类型细胞通过直接或以旁分泌方式相互协调来维持肾上腺稳态。此外,肾上腺微环境稳态的变化会影响机体一些疾病的发生及进展,例如糖尿病、抑郁症、心血管疾病、炎症等,同样微环境稳态也受到这些疾病的影响。虽然了解肾上腺微环境内具体的细胞类型及特点对于肾上腺疾病的发生发展至关重要。但是,目前我们对这方面的知识十分有限,有关肾上腺微环境的研究往往基于在由数百万个细胞组成的组织样本层面上,缺乏一个系统全面的认识,诸多细节仍然未知,很难发现单个细胞之间的差异和可能在肾上腺疾病进展中发挥重要作用的新的细胞类型,限制了我们对肾上腺相关疾病发生发展机制的理解和治疗水平的提高。单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing sc RNA-seq）是在单细胞水平对全转录组RNA进行高通量扩增与测序从而建立细胞图谱一项新技术。利用sc RNA-seq的优势,我们可以弥补不足。因此,本研究借助10X单细胞转录组测序平台,在单细胞层面上探索人和小鼠正常肾上腺组织内的细胞类型及特点,同时对比人和小鼠正常肾上腺的基因表达差异,目的是建立人和小鼠正常肾上腺组织的单细胞图谱,系统全面认识肾上腺微环境内的细胞类型及特点。方法:1.取人正常肾上腺组织,采用酶消化法分离出单细胞悬液。达到合格上机条件的单细胞悬液制备成c DNA文库,检测合格的c DNA文库外送进行测序,运用cell ranger、seurat、monocle等单细胞相关分析软件,对肾上腺测序结果数据进行质量控制、细胞聚类和细胞亚群分析、拟时态分析、细胞周期分析、差异性基因表达等方面的分析。2.单细胞层面上对比分析人左侧肾上腺和右侧肾上腺之间基因表达的相关性和差异性。同时,对比分析节律相关基因（CLOCK,NPAS2,ARNTL,ARNTL2,PER1,PER2,CRY1,CRY2和RORA）在左侧肾上腺和右侧肾上腺皮质细胞上的表达情况。运用q PCR进一步对比分析数据中表达明显的节律性基因（RORA,CLOCK,ARNTL和PER1）在左侧肾上腺和右侧肾上腺的表达情况。3.取8周龄C57/BL6小鼠的正常肾上腺组织,采用酶消化法分离出小鼠肾上腺组织单细胞,制备c DNA文库,文库外送测序,运用cell ranger、seurat等分析软件包,采用与人肾上腺数据分析相同的参数标准,对小鼠测序数据进行质量控制、细胞聚类和细胞定义、差异基因表达等方面的分析。4.运用ENSEMBL R package Bio Mart软件将小鼠肾上腺测序数据中的基因名称转换为人同源性基因名称。使用同源性基因的平均表达量来比较人和小鼠细胞亚群之间的相关性,同时对比分析人和小鼠肾上腺四种主要细胞类型（肾上腺皮质细胞（z G和z F细胞）,肾上腺髓质细胞,内皮细胞和纤维细胞）,确定出人特异性,小鼠特异性及共同表达的差异性表达基因。结果1.人肾上腺单细胞测序结果提示了23组细胞亚群:巨噬细胞1,效应CD8+T细胞1,z F细胞,内皮细胞1,效应CD8+T细胞2,效应CD8+T细胞3,记忆CD4-/8-T细胞,中性粒细胞,NK细胞,浆细胞,z R细胞,巨噬细胞2,z G细胞,效应CD4-/8-T细胞,巨噬细胞3,内皮细胞2,内皮细胞3,血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells VSMC）,成纤维细胞,成熟B细胞,新细胞1,肾上腺髓质细胞,新细胞2。其中第20和22亚群细胞为目前文献尚未见报道的新肾上腺细胞群。2.肾上腺微环境中存在大量的免疫细胞,巨噬细胞和T细胞为主要的免疫细胞亚群。3.Pseudotime分析结果显示z G细胞位于分化轨迹的初始阶段,z F细胞位于中间,最后是z R细胞,一定程度上提示肾上腺皮质细胞从z G向z F迁移,再通过z F向z R的同心圆分化。4.单细胞层面上左侧肾上腺和右侧肾上腺细胞之间的基因表达存在一定的差异。5.小鼠肾上腺单细胞测序结果提示了18组细胞亚群:内皮细胞1,巨噬细胞1,z G细胞,CD8+T细胞1,NK细胞,z F细胞1,z F细胞2,巨噬细胞2,嗜中性粒细胞,成纤维细胞,B细胞,巨噬细胞3,红细胞,肾上腺髓质细胞,内皮细胞2,巨噬细胞4,脂肪细胞,CD8+T细胞2。6.人和小鼠肾上腺单细胞测序数据对比中,二者之间的细胞类型构成和差异性基因表达存在一定的相关和差异性。结论借助10X单细胞测序平台,我们构建了人和小鼠正常肾上腺组织的单细胞图谱,并在单细胞层面对比分析了二者的相关和差异性,为课题的下一步功能研究提供了基础,同时为肾上腺疾病细胞治疗方面的相关研究提供了新的线索。