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第一部分PLAC1在乳腺癌组织中的表达情况与肿瘤预后的相关性分析。目的:阐明人乳腺癌组织中PLAC1的表达与临床各参数之间的相关性以及PLAC1的表达与患者预后的关系。方法:采用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）的方法检测250例人乳腺癌组织中PLAC1的表达情况;应用χ2检验分析PLAC1的表达与各临床参数之间的相关性,采用COX回归分析以及Kaplan–Meier曲线研究PLAC1的表达对乳腺癌是否具有预后意义。结果:利用χ2检验分析免疫组织化学（IHC）结果,在250例乳腺癌组织标本中,PLAC1蛋白的表达与乳腺癌的临床分期（P=0.035）、淋巴结转移状态（P=0.001）以及激素受体水平（P=0.023）水平之间存在明显的相关性。与患者年龄（P=0.097）、肿瘤大小（P=0.082）、肿瘤分级（P=0.772）以及HER2（P=0.62）水平无明显相关性。COX回归分析显示在250例患者中,肿瘤的分期（P=0.002,HR=1.937,95%CI=1.267-2.962）、HER2（P<0.001,HR=0.345,95%CI=0.217-0.549）和激素受体水平（P<0.001,HR=0.231,95%CI=0.149-0.359）是患者整体生存（OS）的影响因素。肿瘤大小（P=0.004,HR=0.516,95%CI=0.330-0.809）、肿瘤的分期(P<0.001,HR=2.199,95%CI=（1.445-3.345）、HER2（P=0.003,HR=0.513,95%CI=0.332-0.793）、激素受体水平（P<0.001,HR=0.301,95%CI=0.194-0.468）以及PLAC1（P<0.001,HR=2.261,95%CI=11.480-3.454）表达水平是患者无转移生存（MFS）的独立危险因素;分层研究在早期乳腺癌T1-T2患者中,PLAC1的表达水平是患者OS（P=0.002,HR=2.547,95%CI=1.422-4.563）、MFS（P=0.001,HR=2.738,95%CI=1.549-4.804）的独立危险因素。Kaplan–Meier曲线分析揭示,PLAC1的高表达与乳腺癌患者较短期的无转移生存之间有显著的相关性（log-rank test,P<0.001）;在早期乳腺癌T1-T2中,PLAC1的高表达与乳腺癌患者较短的生存时间（log-rank test,P=0.012）以及较短的无转移生存（log-rank test,P<0.001）之间存在显著的相关性。结论:PLAC1蛋白的表达水平与患者临床分期、淋巴结转移状态以及激素受体水平之间存在显著的相关性。肿瘤组织中PLAC1的高表达预示着患者发生复发转移的风险以及更早发生转移的可能性较大;而在早期乳腺癌T1-T2患者中PLAC1不仅是肿瘤转移的独立风险因素,且是患者整体生存时间的独立风险因素,高表达的PLAC1预示患者较短的生存时间以及较早的转移可能。第二部分PLAC1促进体内和体外乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。目的:从体内和体外明确PLAC1的表达对人乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法:利用RT-PCR和Western blot检测各乳腺癌细胞系中PLAC1的表达水平,并根据各细胞Plac1蛋白的表达水平,选取MDA-MB-231和MCF-7细胞进行研究。在人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞系中,构建PLAC1过表达和敲低的人乳腺癌稳转细胞株。应用Western Blot验证PLAC1在人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7稳转细胞株中的蛋白表达水平;利用Transwell迁移实验研究PLAC1在体外对人乳腺癌细胞的迁移能力影响;利用Transwell侵袭实验研究其在体外人乳腺癌细胞侵袭能力的变化。应用PLAC1过表达和空载对照的MDA-MB-231细胞经裸鼠尾静脉注射造乳腺癌侵袭转移模型研究PLAC1在体内对人乳腺癌细胞的侵袭转移能力的影响。H&E染色检测被用来检测裸鼠肝和肺的病变情况。结果:在人乳腺癌MDA-MB-231-PLAC1和MCF-7-PLAC1稳转细胞系中,PLAC1表达水平明显高于空载对照组;在MDA-MB-231-shRNA和MCF-7-shRNA稳转细胞系中,PLAC1表达式水平明显低于空载对照组。Transwell迁移实验证明,过表达PLAC1的MDA-MB-231和MCF-7细胞相对于空载对照组穿过小室基底膜的细胞数明显增多（p<0.05）。在MDA-MB-231和MCF-7细胞中PLAC1蛋白的敲低可明显抑制肿瘤细胞穿过小室基底膜（p<0.05）。在Transwell侵袭实验实验中,过表达PLAC1的MDA-MB-231和MCF-7细胞系相对于对照组穿过小室基底膜的细胞数明显增多（p<0.05）。在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞中PLAC1蛋白被敲低可明显抑制肿瘤细胞穿过小室基底膜（p<0.05）。体内实验中,在肉眼和H&E染色后镜下观察裸鼠肺和肝的肿瘤转移灶发现过表达PLAC1的MDA-MB-231细胞组相较于对照组肿瘤平均转移灶明显增多（p<0.05）。结论:PLAC1蛋白的过表达可明显增强人乳腺癌细胞在体外的迁移、侵袭能力;敲低乳腺癌细胞PLAC1蛋白水平可明显抑制乳腺癌细胞在体外的迁移、侵袭能力。PLAC1蛋白的过表达可明显促进乳腺肿瘤细胞在体内的侵袭、转移能力。第三部分PLAC1促进人乳腺癌细胞迁移、侵袭转移的分子机制研究目的:根据前期研究结果表明PLAC1可以增强乳腺癌细胞的体内和体外侵袭转移能力,但其具体的作用机制尚不清楚,本部分主要目的旨在明确PLAC1通过何种可能的分子机制发挥其生物学功能。方法:利用免疫共沉淀结合蛋白质谱分析检测MCF-7细胞中与内源性PLAC1相互结合的蛋白,筛选与PLAC1共作用促进乳腺癌侵袭转移的可能蛋白Furin。基因芯片分析PLAC1过表达后下游因子变化情况,明确PLAC1可能的调控机制。CO-IP和激光共聚焦进一步明确PLAC1和Furin是直接相互结合。在PLAC1过表达的MDA-MB231和MCF-7细胞以及各自空载对照组分别转染Furin的siRNA和对照,并通过挽救实验明确PLAC1是否通过与Furin相互作用促进乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。Western Blot检测PLAC1过表达后下游通路相关因子变化情况,以及挽救实验中敲低Furin后其下游相关分子的改变情况。在PLAC1过表达的MDA-MB231和MCF-7细胞以及各自空载对照组分别转染PTEN质粒和空载对照,同样应用transwell挽救实验明确PLAC1是否是通过调节下游PTEN的变化而促进乳腺癌细胞迁移和侵袭转移的。IHC被用来检测PLAC1过表达与对照组裸鼠肝和肺组织标本中相关通路蛋白表达情况。结果:免疫共沉淀和蛋白质谱分析结果显示Furin蛋白和PLAC1蛋白存在相互结合关系,CO-IP和细胞免疫荧光共定位进一步明确Furin和PLAC1是相互结合蛋白;基因芯片结果显示,PLAC1的表达增加可以显著激活PI3K/AKT信号通路并且明显抑制该通路上关键调节因子PTEN的表达;Western Blot结果同样也证明在稳定表达PLAC1的人乳腺癌细胞系MDA-MB231和MCF-7中PLAC1能够调节Furin下游蛋白NICD、Hes1以及PTEN和PI3K/AKT通路相关蛋白及其下游MMP2和MMP9等蛋白的变化。挽救实验中,在PLAC1过表达的MDA-MB231和MCF-7细胞系以及各自空载对照组中转染Furin的siRNA并利用Transwell迁移实验证明,在Furin被敲低的PLAC1过表达组,MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系相对于转染空载的PLAC1过表达组穿过小室基底膜的细胞数明显减少（p<0.05）。Transwell侵袭实验实验中,在Furin被敲低的PLAC1过表达组,MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞相对于转染空载的PLAC1过表达组穿过小室基底膜的细胞数明显减少（p<0.05）。同样在PLAC1过表达的MDA-MB231和MCF-7细胞以及各自空载对照组中转染PTEN质粒并由Transwell迁移实验证明,PLAC1和PTEN同时过表达的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系相对于只有PLAC1过表达组穿过小室基底膜的细胞数明显减少（p<0.05）。Transwell侵袭实验实验中,在PLAC1和PTEN同时过表达的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系相对于只有PLAC1过表达组穿过小室基底膜的细胞数明显减少（p<0.05）。Western Blot结果显示Furin的敲低可明显逆转PLAC1过表达所诱导的NICD、Hes1以及PTEN和PI3K/AKT通路相关蛋白及其下游MMP2和MMP9等蛋白的变化。IHC检测PLAC1过表达与对照组裸鼠肝和肺组织标本NICD、PTEN、MMP2和MMP9等相关通路蛋白情况,证明在体内PLAC1的过表达可调控Furin下游NICD和PI3K/AKT等相关蛋白变化。结论:PLAC1蛋白是通过与Furin蛋白之间的相互作用调控下游NICD、Hes1蛋白水平变化从而影响PTEN蛋白的表达,即PI3K/AKT信号通路被活化进而发挥其促进乳腺癌侵袭转移的生物学功能。