目的:哮喘是一种慢性气道疾病,它被认为是由遗传和环境等共同引起的多因素疾病。人气道上皮细胞（HAEC）处于人体与周围环境的交界处,是呼吸道抵御外界刺激,如微生物、过敏原等的第一道防线。由于实验过程中无法在人体支气管内行任何形式的损伤,对于上皮细胞损伤修复的研究多采用细胞培养的方式。其中,气液平面细胞培养模式（ALI）在最大程度上模拟了人体内情况,培养的细胞会处于极化状态,细胞的上层会分化出纤毛。但ALI培养状态下,细胞间连接紧密,划伤实验不稳定,且难以观察。所以对ALI培养下HAEC损伤修复过程的研究具有挑战性。白介素13（IL-13）是一种重要的2型辅助性T细胞（Th2）炎症反应细胞因子,已知IL-13与气道上皮重塑相关,它对损伤修复能力的影响尚存在矛盾。有人认为,虽然IL-13会引起一系列的炎症反应,使哮喘进展,但它可以使HAEC愈合增快,对细胞损伤修复起促进作用。更多研究认为IL-13降低HAEC损伤修复。15位脂氧合酶-1（15LO1）是一种脂氧合酶,Th2反应影响上皮细胞的因素之一,15 LO1可催化多不饱和脂肪酸的氧化。15LO1及其产物在哮喘肺组织中升高,在体外培养环境下,白介素4（IL-4）和IL-13上调15LO1。目前,并没有关于15LO1对支气管上皮细胞损伤修复影响的研究。本实验旨在探索新的划伤方式,研发新的、简单易操作的损伤设备,以提高ALI培养状态下,上皮细胞损伤的一致性,从而标准化地比较不同疾病状态下、不同刺激条件下,细胞损伤修复的差别。同时探索新的观察方式,以得到清晰的ALI培养细胞图像,观察损伤修复过程中细胞迁移的动态过程。利用新发明的损伤器械及新建立的观察方法,对比哮喘患者HAEC与正常人细胞损伤修复能力的差别,并评价IL-13对损伤修复的影响,再评价其下游15LO1对HAEC损伤修复的影响,并观察细胞迁移和增殖在其中的作用。方法:1.支气管镜检采集正常人（HC）、轻中度哮喘患者（MMA）和重度哮喘患者（SA）的HAEC,通过ALI培养方式获得接近人体支气管内情况的上皮细胞,并研制新的损伤器械,改进ALI培养状态下细胞划伤的方式,与传统加样枪头所行的划伤方式进行对比。采集2mm×10mm大范围细胞划伤及愈合图像,以较大面积的损伤图像采集避免局部小范围采集引起的误差。获得规则图像后,连续观察细胞损伤修复情况,确定最佳观察时长及间隔。建立新的显微镜下ALI培养方式,这种新方式在持续显微镜下观察细胞损伤修复及运动情况的同时,也保持ALI培养状态。观察发现,损伤修复在24小时内最为活跃。接下来,在24小时内,进行每20分钟一次的显微镜拍照,获得细胞运动的连续动态图像,观察每个细胞迁移状态,IMARIS软件分析每个时间点、每个细胞的X轴、Y轴坐标。在spyder软件中anaconda运算环境下,通过Python程序计算每个细胞在每个时间点的迁移总速度、沿X轴正向迁移速度以及各组样本正向愈合细胞百分比,研究损伤修复过程中,HAEC的具体迁移过程。2.本实验通过上述新的划伤方式对比HC对照组、MMA组和SA组HAEC在ALI状态下损伤修复整体情况,并观察IL-13对损伤修复的影响,之后在IL-13刺激条件下观察15LO1酶抑制剂BLX2477对损伤修复的影响。利用上述新的显微镜下ALI培养方式观察细胞迁移,获得每个细胞迁移路径,对比上述不同疾病状态、不同刺激条件下,细胞迁移总速度、沿X轴正向迁移速度及正向愈合细胞百分比。为了进一步比较HC对照组、MMA患者和SA患者细胞迁移方向的差异,将迁移方向分为两个参数,即细胞迁移相对于水平线的平均角度Theta（θ）和迁移方向逆变率Kappa（κ）来分析细胞迁移方向。对损伤后的HAEC行免疫荧光染色,统计Ki67及Ed U阳性染色细胞比例,对比不同刺激条件下细胞增殖的差异。结果:1.对比传统用加样枪头进行的划伤与新研制的损伤器械划伤的区别可见,加样枪头划伤区域形状不规则,划伤两侧边缘距离在各水平线上差别很大,划痕边缘可见细胞大片折叠区域。而改良的划伤方式划伤区域形状规则,近似长方形,划伤两侧边缘距离在各水平线上差别不大,划伤更为稳定。采集2mm×10mm大范围细胞划伤及愈合图像,以这种较大面积的损伤图像采集可以避免局部小范围采集引起的误差。每8小时采集一次,连续观察损伤修复图像,可见正常HAEC在24小时左右即接近完全愈合。根据上述损伤修复观察可知,HAEC在24小时内损伤修复更为活跃,新建立的显微镜下ALI培养系统观察此时段内细胞迁移情况,分析单个上皮细胞的迁移轨迹,进一步得出细胞迁移的具体参数:迁移总速度、沿X轴正向迁移速度及正向愈合细胞百分比,可评估HAEC损伤修复过程中的具体迁移状态。2.对比不同来源及不同刺激条件下上皮细胞48小时内损伤修复情况可见,HC组在24小时即达到100%愈合,MMA组及SA组较HC组损伤修复明显降低。比较HC组、MMA组、SA组所有样本加入IL-13后总体情况可见,细胞损伤修复明显下降,其中HC、MMA组,加入IL-13后,细胞损伤修复明显下降,而SA组,加入IL-13后,细胞损伤修复的下降无统计学意义。在加入IL-13的同时,对各组细胞分别加入DMSO及15LO1酶抑制剂BLX2477,IL-13+BLX组与IL-13+DMSO组相比,细胞损伤修复明显升高,总体及各组内均有明显统计学意义。细胞迁移实验显示,HC组、MMA组、SA组细胞迁移总速度、正向愈合细胞百分比无明显差别,但HC组X轴移动速度高于MMA组及SA组,MMA组高于SA组。加入IL-13后,细胞迁移总速度、X轴移动速度及正向愈合细胞百分比均明显下降。加入IL-13同时,分别加入DMSO及BLX2477,IL-13+BLX组与IL-13+DMSO组相比,细胞迁移总速度、X轴移动速度及正向愈合细胞百分比均明显升高。细胞增殖实验显示,IL-13在损伤初期提高细胞增殖,加入15LO1酶抑制剂或转染降低15LO1的表达均可以降低IL-13对增殖的影响。结论:1.新研制的损伤器械划伤形状规则,划伤更为稳定。连续48小时采集损伤修复图像,保证了观测损伤修复整体过程的完整性,为观察各种疾病状态、不同刺激条件下的完整损伤修复过程及愈合情况提供条件。利用新建立的显微镜下ALI培养系统,观察到损伤修复前24小时,即最为活跃时段细胞迁移总速度、沿X轴正向迁移速度及正向愈合细胞百分比,可描述HACE迁移情况对损伤修复的影响。2.正常人HAEC损伤修复能力高于哮喘患者,细胞迁移状态优于哮喘患者。IL-13通过影响细胞迁移速度、方向降低HAEC损伤修复,而细胞增殖在此过程初期不起主要作用。15LO1酶抑制剂可降低IL-13对损伤修复的影响,通过提高细胞迁移速度改善HAEC损伤修复。