背景:类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性炎性自身免疫病。以滑膜增生,炎症细胞浸润,血管翳形成为主要病理特征。RA患者的外周血和滑膜局部存在的复杂细胞因子及趋化因子网络使炎症环境持续存在。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）既是RA关节炎症损伤的效应细胞,也可导致关节软骨和骨的破坏。在关节靶向阶段,FLS与固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用,产生大量炎性细胞因子,进而构建了RA关节中的促炎微环境,FLS与其相关的细胞因子在RA的发生中起到关键作用。其中IL-6作为发挥核心作用的促炎因子,通过与FLS及其他免疫细胞的相互作用,促进组织损伤、急性期反应及自身免疫反应,在RA的发病机制中发挥多种作用。IL-6R拮抗剂已经在临床反馈中取得非常好的疗效,调控IL-6信号转导途径被视为治疗RA的重要靶点。鞘脂类是细胞膜的重要组成部分,且与许多细胞功能息息相关。鞘脂类对IL-6的生成有调节作用,同时TNF-α及IL-1β等促炎性细胞因子可以影响鞘脂类的代谢。鞘脂类相互代谢是在许多酶的参与下逐步进行的。其中,神经酰胺是鞘脂类的核心,通过重组给定的信号体,在多种疾病和免疫调节中发挥诸多功能。神经酰胺打捞途径相关酶ASM（Acid Sphingomyelinase,酸性鞘磷脂酶）和GBA1（Acidβ-glucosidase 1,酸性β葡糖苷酶1）与肿瘤细胞生成IL-6相关,ASM/神经酰胺通过p38途径,在IL-6m RNA表达的稳定性中起独立的正向作用,从而使IL-6生成增加。且ASM通过调节IL-6的生成,参与肿瘤细胞的侵袭性病理生物学行为。而GBA1在乳腺癌细胞中则以GBA1-神经酰胺-p38δ途径与IL-6的生成负相关。因此本课题组推测神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38途径调控RAFLS生成IL-6,进而可能影响RAFLS的异常增殖、抗凋亡、迁移及侵袭能力,参与RA的疾病进程。本研究将采用RA患者外周血和FLS作为研究对象,深入探讨神经酰胺合成酶ASM和GBA1在RA中对IL-6的调控作用及其相关作用机制。第一部分:类风湿关节炎患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达情况目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在RA患者外周血中的表达情况,以及与TNF-α、IL-6及其他临床指标进行相关性分析。方法:收集中国医科大学附属第一医院风湿免疫科住院符合2010年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）修订的RA分类诊断标准的RA患者42例,以及同期年龄、性别匹配的健康对照15例。收集患者年龄、性别、病程、合并脏器受累情况、药物治疗史,肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）、VAS评分、红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽抗体（anti-CCP）及临床常规实验室检查结果,评估疾病活动度（DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI）及关节骨侵蚀分级（双手X线平片）。应用ELISA法检测RA患者外周血清中的ASM和GBA1以及TNF-α、IL-6的水平。两组间的差异符合正态分布样本应用独立样本t检验,非正态分布数据应用Mann-Whitney秩和检验。血清中ASM和GBA与细胞因子TNF-α、IL-6以及各临床相关指标之间的相关性分析采用Spearman相关性分析（非参数相关性分析）。结果:42例RA患者中处于缓解及低疾病活动度（DAS28-CRP≤3.2）有4例（10%）,中度疾病活动度（3.2<DAS28-CRP<5.1）有13例（41%）,重度疾病活动度（DAS28-CRP≥5.1）25例（59%）,入选RA患者以中重度疾病活动度居多。RA患者组血清中的ASM和GBA1表达水平与健康对照组相比显著增高（p=0.0419,p<0.0001）。进行Spearman相关性分析,结果发现血清GBA1水平与IL-6（r=-0.4957,p=0.0008）呈负相关;与PLT（r=0.4625,p=0.002）和CRP（r=0.3946,p=0.0097）呈正相关;而血清ASM与GBA1、IL-6、TNFα以及PLT、ESR、CRP、RF、anti-CCP等临床相关指标无显著相关性。结论:RA患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达水平升高,GBA1与IL-6的水平呈负相关。ASM和GBA1可能通过调控炎症的不同作用参与RA的发病。第二部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的作用目的:分离、培养及鉴定RAFLS;研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1对RAFLS产生IL-6以及增殖、凋亡、迁移及侵袭的调控作用。方法:10例符合诊断标准RA患者在骨科及运动医学科进行膝关节置换术后,留取滑膜组织标本,应用酶消化法获得原代FLS,采用免疫荧光检测FLS中Vimentin的表达情况进行鉴定。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。采用CCK8法检测细胞增殖,采用流式细胞术（Annexin V/PI）检测细胞凋亡,应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:体外分离、培养的原代滑膜细胞,传代至（P3-4）高表达Vimentin,鉴定为RAFLS。应用不同浓度IL-1β刺激RAFLS不同时间,各不同刺激时间组内,IL-1β2.5ng/ml和IL-1β10ng/ml组细胞上清中IL-6含量均较空白对照组有显著升高（p<0.05,p<0.0001）,选择2.5ng/ml诱导24小时作为刺激RAFLS的作用条件。托珠单抗（IL-6R拮抗剂）、地昔帕明（ASM抑制剂）、托珠单抗联合地昔帕明及托珠单抗联合环己烯四醇β环氧化物（GBA抑制剂）均可显著下调由IL-1β刺激RAFLS中的IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.05、p<0.001或p<0.0001）;环己烯四醇β环氧化物可显著上调IL-1β刺激RAFLS中IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.0001）;托珠单抗联合地昔帕明较单用托珠单抗组的IL-6蛋白和m RNA表达显著下降（p<0.05、p<0.0001）。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显著抑制IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.01、p<0.05、p<0.001）;而环己烯四醇β环氧化物则显著增加IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.05）,各组药物对细胞凋亡无明显影响。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显著抑制IL-1β诱导的RAFLS的迁移和侵袭能力（p<0.05）;而环己烯四醇β环氧化物则显著增加IL-1β诱导以及托珠单抗处理的RAFLS迁移和侵袭能力（p<0.05、p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂可以下调RAFLS分泌IL-6及抑制RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,且功能性ASM抑制剂与IL-6拮抗剂伍用,可以协同抑制RAFLS分泌IL-6及RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能。因此三环类抗抑郁药等功能性ASM抑制剂可能对RA的关节滑膜炎症有潜在的治疗作用,并可以与IL-6拮抗剂联合应用进行协同治疗。而GBA1抑制剂可以上调RAFLS分泌IL-6并增强RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,GBA1可能参与RA的疾病进程。第三部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的生成目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1调控RAFLS产生IL-6的分子机制。方法:采用原代分离培养并经过鉴定的P3-6的RAFLS进行实验。应用Western Blot法测定RAFLS MAPK信号通路中p38α、p38δ、ERK、JNK及蛋白磷酸化水平。构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体并转染RAFLS,应用Real-time PCR方法和Western Blot方法检验沉默慢病毒转染RAFLS后GBA m RNA、ASM m RNA和GBA和ASM的蛋白表达。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。结果:地昔帕明、托珠单抗及地昔帕明+托珠单抗可以显著抑制IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）;地昔帕明+托珠单抗较托珠单抗组显著下调IL-1β诱导p38α、p38δ磷酸化水平（p<0.01、p<0.05）。而环己烯四醇β环氧化物则可以显著上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.05、p<0.01、p<0.0001）。构建沉默慢病毒质粒转染RAFLS,与阴性对照感染组相比,LV-GBA及LV-ASM转染组相应m RNA及蛋白表达显著下降。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显著上调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.001）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显著下调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显著上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001、p<0.01、p<0.05、p<0.01）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显著下调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）。p38 MAPK抑制剂SB202190可以显著下调GBA和ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS经IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂和ASM沉默慢病毒均可以通过抑制p38活化进而下调RAFLS分泌IL-6,功能性ASM抑制剂和IL-6拮抗剂伍用可以协同抑制p38活化。GBA抑制剂和GBA沉默慢病毒可以通过激活p38通路进而促进RAFLS分泌IL-6。