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研究背景：宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的发病率最高的恶性肿瘤。虽然某些类型人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染己被证实是宫颈癌发生中的重要因素，但感染者中仅有少部分发展成宫颈癌，说明单纯HPV感染不足以导致肿瘤的发生和发展，在宫颈癌的发生中可能有其他因素参与。近年来大量的研究表明，肿瘤的发生不但存在遗传学上的改变，而且存在表遗传学的改变。表遗传能改变基因的表达，而不引起DNA序列的改变。不同于遗传改变，表遗传改变往往是可逆转的，DNA甲基化即表遗传的表现之一。
DNA甲基化是真核细胞DNA最普遍的修饰过程，其主要特征是广泛癌基因低甲基化和部分区域抑癌基因高甲基化共存，抑癌基因启动子区的高甲基化引起其转录抑制，进一步导致基因失活，从而推测DNA甲基化参与肿瘤的发生和发展。目前已发现在多种人类肿瘤中存在抑癌基因高甲基化，在宫颈癌的发生、发展中亦存在DNA甲基化水平和模式的紊乱。研究证实应用甲基化抑制剂干预肿瘤细胞后可以使抑癌基因的高甲基化状态得到逆转，从而达到治疗肿瘤的目的。
RAS相关区域家族1A基因(Ras association domain family 1A，RASSF1A)是一个新发现的候选抑癌基因，已在多种人类恶性肿瘤如肺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌中发现其存在高甲基化。目前，对于宫颈癌中RASSFIA基因甲基化情况研究较少。RASSFIA作为抑癌基因，在抑制肿瘤的发生和发展中的确切机制目前仍未十分清楚。凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)基因位于染色体12q23，是已被确认的抑癌基因。Apaf-1是哺乳动物细胞中类似线虫CED-4的同源蛋白，是参与激活凋亡过程中Caspase系统的关键因子，被认为是凋亡的核心，研究发现其功能失活与基因的高甲基化状态有关。Apaf-l基因高甲基化状态已在多种人类肿瘤中被发现。目前，关于Apaf-l基因在宫颈癌中的甲基化情况仍未见相关文献报道。 5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是一种嘧啶核苷类似物，可整合到DNA中并与甲基转移酶结合形成一种共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，使多种因高甲基化而失活的抑癌基因重新表达，恢复抑癌基因的功能。针对肿瘤抑癌基因高甲基化的机制来探讨肿瘤治疗是一种新的思路。目前5-Aza-CdR 在临床上已被应用于血液系统恶性肿瘤的治疗并取得一定的疗效，而其在宫颈癌的临床应用尚未见相关文献报道。
本研究探讨甲基化抑制剂5-Aza-CdR对宫颈癌细胞株生物学行为的影响，以及5-Aza-CdR对宫颈癌细胞株作用的可能机制，为5-Aza-CdR治疗宫颈癌提供实验依据，也为宫颈癌的治疗提供新的思路。
目的：(1)应用甲基化抑制剂5-Aza-CdR分别作用于人宫颈腺癌细胞株HeLa和人宫颈鳞癌细胞株SiHa，观察其对细胞增值及凋亡的影响。(2)探讨5-Aza-CdR对宫颈癌细胞增殖和凋亡作用的可能机制。
方法：(1)分别使用20μmol/L、10μmol/L，5μmol/L、2.5μmol/L四种不同浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的人宫颈腺癌细胞株HeLa和人宫颈鳞癌细胞株SiHa24h、48h、72h。(2)通过MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR对宫颈癌细胞株HeLa、SiHa生长抑制率的影响。(3)应用流式细胞仪检测5-Aza-CdR处理72h对宫颈癌细胞株HeLa、SiHa凋亡率的影响。(4)RT-PCR方法检测不同5-Aza-CdR处理对宫颈癌细胞中抑癌基因RASSF1A、Apaf-1 mRNA表达的影响。
结果：(1)5-Aza-CdR作用于宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞24h、48h、72h后，细胞增殖均受到抑制。药物作用72h后HeLa细胞各组生长抑制率分别为(38.30±0.95)％、 (16.15±0.71)％、 (8.53±1.41)％、 (5.63±1.38)％，各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。药物作用72h后SiHa细胞各组生长抑制率分别为(21.16±1.70)％、(19.24±1.55)％、(17.30±2.59)％、(18.24±2.40)％，各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。 (2)5-Aza-CdR处理宫颈癌HeLa细胞72h后，5μmol/L浓度组凋亡率为(6.63±0.41)％，高于对照组的(4.35±0.60)％，差异有统计学意义(p<0.05)。药物处理宫颈癌SiHa细胞72h后，20μmol/L浓度组凋亡率为(9.71±1.85)％，高于对照组的(5.86±1.20)％，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)5-Aza-CdR处理前宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞中均存在RASSF1A mRNA表达，但药物处理后2种细胞的表达率无显著增加(P>0.05)。 (4)5-Aza-CdR处理前宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞均存在Apaf-1 mRNA表达，药物处理后HeLa细胞表达增高，20μmol/L浓度组Apaf-1 mRNA相对含量为(0.790±0.056)％，高于对照组的(0.585±0.132)％，差异有统计学意义(P<0.05)。药物处理后SiHa细胞Apaf-1mRNA表达增高，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
结论：(1)5-Aza-CdR可抑制宫颈癌HeLa细胞株和SiHa细胞株增殖。对HeLa细胞作用呈剂量依赖性，对SiHa细胞作用呈时间依赖性。(2)5-Aza-CdR可促进宫颈癌HeLa细胞株和SiHa细胞株凋亡。(3)RASSF1A基因不是5-Aza-CdR导致宫颈癌HeLa细胞株和SiHa细胞株凋亡和增殖的相关基因。(4)Apaf-1基因是5-Aza-CdR导致宫颈癌HeLa细胞株凋亡和增殖的相关基因。(5)Apaf-1基因不是5-Aza-CdR导致宫颈癌SiHa细胞株凋亡和增殖的相关基因。