【摘 要】
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目的皮质骨变薄和骨密度降低是衰老相关性皮质骨疏松的最显着特征,是老年人脆性骨折的根本原因。然而,衰老相关性皮质骨质疏松症发生的机制尚不清楚。最新研究表明,骨祖细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号是调节骨代谢的重要因素。因此,本研究旨在阐明皮质骨内膜骨祖细胞EGFR信号在衰老微环境诱导皮质骨质疏松症中的作用机制。方法为了研究年龄相关性
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目的皮质骨变薄和骨密度降低是衰老相关性皮质骨疏松的最显着特征,是老年人脆性骨折的根本原因。然而,衰老相关性皮质骨质疏松症发生的机制尚不清楚。最新研究表明,骨祖细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号是调节骨代谢的重要因素。因此,本研究旨在阐明皮质骨内膜骨祖细胞EGFR信号在衰老微环境诱导皮质骨质疏松症中的作用机制。方法为了研究年龄相关性皮质骨改变,我们选取3月龄和15月龄的C57BL/6小鼠（n=5/组）的股骨用于影像学及组织学分析。为了明确表皮生长因子受体（EGFR）信号通路在年龄相关性皮质骨疏松中的作用,我们将15月龄C57BL/6小鼠分成两组（n=5/组）,对照组用采用溶剂处理,处理组给予吉非替尼（EGFR抑制剂）处理。灌胃（100mg/kg/天）4周后,将股骨和胫骨用于影像学及组织学分析。此外,我们培养原代骨祖细胞并用50ng/ml EGF处理,或加入相应抑制剂例如gefinitib（10μM）,U0126（10μM）,EPZ-6438（10μM）。处理 72 小时后,收获RNA和蛋白质用于基因及蛋白表达分析,SA-β-Gal染色用于检测细胞衰老。结果MicroCT结果显示,15月龄小鼠股骨远端干垢端出现了类似松质骨的骨小梁结构,并且,相比于3月龄年轻小鼠,15月龄中年小鼠皮质骨的厚度（Ct.Th）、骨密度（BMD）、皮质骨面积（Ct.Ar）显著下降,而皮质骨骨外膜周长（Ct.Pe.Pm）和皮质骨骨内膜周长（Ct.En.Pm）显著增加。结果表明,相比于3月龄小鼠,15月龄小鼠的股骨皮质骨明显退化。CFU-F结果提示15月龄小鼠的骨祖细胞数量减少,增殖减弱。随后,免疫荧光证实15月龄小鼠OSX+p1 6INK4A+细胞数量增加,Osx+Ki67+细胞数量减少,且15月龄小鼠骨组织中p16INK4A及p53基因表达显著上调,提示15个月龄小鼠骨祖细胞老化增加,增殖减弱。然后,我们对3月龄和15月龄小鼠中p-EGFR和EZH2的表达进行了 WB和免疫荧光检测,结果表明15月龄小鼠中骨祖细胞p-EGFR和EZH2的表达均下调,提示:骨祖细胞老化可能跟EGFR信号通路相关。随后,我们将15月龄小鼠分成两组,并进行对照溶剂（对照组）和Gefitinib（EGFR抑制剂,处理组）灌胃4周处理,随后对相关指标进行检测。microCT结果显示,相比于对照组,实验组在皮质骨厚度（Ct.Th）和皮质骨面积（Ct.Ar）均显著下降,皮质骨骨内膜周长（Ct.En.Pm）明显增加。此外,相比于对照组小鼠,处理组小鼠骨内膜Osx+p16INK4A+细胞数量显着上升,SA-β-Gal染色结果显示,EGF组细胞衰老较少,EGF+Gefinitib组细胞衰老较多。同时,相比于单纯EGF处理组,EGF+Gefitinib处理组中p16INK4A和p53的表达上调。提示:骨祖细胞衰老是皮质骨退行性变发生的关键,而骨祖细胞EGFR信号可能可以抑制细胞衰老。同时,我们发现,相比于3月龄,15月龄小鼠和中Osx+p-ERK+细胞表达下调。并且,我们发现,相比于EGF处理组,p16INK4A和p53的表达在EGF+U0126（ERK抑制剂）组中显著上调。同时,SA-β-Gal染色结果也显示EGF组细胞衰老数较少,EGF+U0126组细胞衰老较多。提示:骨祖细胞EGFR信号通过ERK1/2通路抑制细胞衰老。最后,相比与3月龄和对照组小鼠,骨组织中Ezh2含量及Osx+Ezh2+细胞数量在15月龄小鼠及处理组小鼠中显著下调。同样,体外实验也证实,p16INK4A和p53的表达在EGF组中下调,但在EGF+EPZ（EZH2抑制剂）组中上调。同时,SA-β-Gal染色结果显示EGF组细胞衰老数较少,EGF+EPZ（EZH2抑制剂）组细胞衰老较多。此外,EZH2的表达在EGF组中上调,但在EGF+U0126（ERK抑制剂）组下调。提示:EGFR/ERK可能通过EZH2抑制骨祖细胞衰老。结论皮质骨骨祖细胞EGFR信号可能通过ERK通路激活Ezh2,维持细胞增殖并抑制细胞老化。
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