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第一部分:TNAP在急性心肌梗死后的表达特征及意义目的:探讨组织非特异性碱性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase,TNAP)在急性心肌梗死后的表达特征及意义。方法:(1)为探讨血清TNAP在急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者中的表达特点,本研究首先纳入从2018年1月至2018年5月,于重庆医科大学附属第一医院就诊,且行冠状动脉造影明确诊断为急性冠脉综合症(acute coronary syndromes,ACS)的患者56例,并分为不稳定型心绞痛(unstable angina,UA)组(n=29)及急性心肌梗死(AMI)组(n=27)。为探讨ST段抬高型心肌梗死(st-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者血清TNAP与预后的关系,纳入从2015年9月17日至2017年7月23日就诊于重庆医科大学第一附属医院的全部STEMI患者,共826例。所有患者数据来自于医院病历系统。收集患者人口统计学数据,临床特征,病史和治疗策略等信息。人体研究中血清TNAP均在具有相同标准的同一实验室中进行检测。主要结局为院内全因死亡。患者的死亡数据通过回顾病历和/或标准化电话随访获取。数据采集及随访过程双盲。随访时间为患者从入院到中位住院时间(9天)。(2)为探讨心肌TNAP在AMI后心脏表达特征,本研究纳入7例因AMI死亡或有心肌梗死病史的死亡患者,分为心梗1天组(n=3)和陈旧性心肌梗死组(n=4)。左前降支结扎的AMI大鼠模型的心脏也同时用于该研究。免疫组化方法检测心肌α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)及TNAP表达,天狼星红染色检测心肌胶原沉积。采用TNAP活性试剂盒及凝胶内TNAP活性两种方法检测心肌TNAP活性。(3)为探讨TNAP抑制剂对心脏TNAP的抑制特点,大鼠经腹腔内注射TNAP抑制剂(Tetramisole,Tetra,11 mg/kg/day)7天,14天,21天,28天后,检测心肌及血清TNAP活性。结果:(1)与UA组患者相比,AMI组患者年龄、性别、是否合并2型糖尿病和原发性高血压以及Genisini评分无明显差异,血清TNAP水平显著上调。在STEMI患者中,受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)显示,TNAP高于109 U/L可能预测院内死亡率。高血清TNAP患者,更倾向于是女性患者,合并较高的舒张压,入院心率,甘油三酯,总胆固醇,apo B,hs CRP,WBC,总蛋白和白蛋白。TNAP高组患者,超声心动图LVEF和LVSF明显降低。其他特征如年龄,收缩压,HDL-C,LDL-C,apo A1,Lp(a),心肌肌钙蛋白T,CK-MB,尿素,肌酐,钠,钾,钙,AST,病史和治疗在组间的差异均无统计学意义。高血清TNAP患者,院内死亡率显著高于低组(P=0.004)。在校正了相关危险因素后,高血清TNAP水平仍与STEMI患者院内死亡有相关性。(2)心肌梗死患者心脏TNAP表达在心梗边缘区上调,与纤维化区域一致。在大鼠心肌梗死模型中,心梗3天后TNAP开始在心梗边缘区表达,心梗14天达高峰,心梗28天仍可观察到TNAP表达,表达位置与胶原重构区域一致。在体内,心梗后心脏TNAP的活性与蛋白表达趋势一致。血清TNAP活性与心梗前无显著变化。(3)予以TNAP抑制剂Tetra后可显著降低血清TNAP活性,该效应可持续14天,随后有逐渐恢复趋势。予以Tetra腹腔注射,可长期抑制心脏TNAP活性。结论:(1)TNAP在心梗后上调,可作为不良预后参考指标。(2)TNAP可能参与心梗后心脏纤维化过程。(3)通过外源性给予TNAP抑制剂可有效抑制心脏TNAP活性。第二部分:抑制TNAP对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞纤维化反应的影响目的:探讨抑制TNAP对转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)诱导的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化反应的影响。方法:从1至3天的新生大鼠中分离出原代CFs,采用外源性人重组TGF-β1蛋白诱导CFs纤维化反应。采用Western blot方法检测TNAP、α-SMA、p-Smad2、Smad2、p AMPK、AMPK及GAPDH表达,采用RT-PCR方法检测α-SMA、Col1a1、Col1a2、Col3a1、Smad7 m RNA表达,采用免疫荧光检测α-SMA表达,采用划痕实验及Transwell实验检测CFs的迁移。结果:人重组TGF-β1蛋白诱导CFs TNAP及α-SMA表达上调,并诱导CFs迁移。予以Tetra抑制TNAP后,TGF-β1诱导的α-SMA表达下调,α-SMA、Col1a1、Col1a2和Col3a1 m RNA水平下调,迁移能力受抑制,Smad7 m RNA水平上调,p Smad2水平下调。Tetra孵育CFs15min,30min后,AMPK Thr183/172位点磷酸化激活。结论:抑制TNAP可能通过AMPK激活,上调Smad7,并抑制TGF/Smads通路的方式发挥抗纤维化作用。提示TNAPAMPK-TGF-β/Smads轴可能与心脏纤维化有关。第三部分:TNAP通过P53通路调控低氧诱导的心肌成纤维细胞的纤维化反应目的:探讨抑制TNAP在低氧诱导的CFs纤维化反应中的作用及机制。方法:分离原代CFs,分别采用常氧及1%O2培养CFs。常氧下,采用Western blot技术检测抑制TNAP后,p53,cyclin E1蛋白水平表达,采用流式细胞技术检测CFs增殖及凋亡水平。采用p53抑制剂(PFT-α)及小干扰RNA(si-RNA)方法抑制或敲低p53,并给予TNAP抑制剂干预后,检测相关纤维化指标的变化。结果:在正常氧供条件下,抑制TNAP可显著上调p53,cyclin E1蛋白水平并抑制CFs增殖能力。在低氧条件下,CFs形态发生改变,抑制TNAP可显著改善低氧诱导的形态变化。低氧下,TNAP表达及活性上调,α-SMA表达上调,细胞迁移能力增强。予以TNAP抑制剂可显著阻断低氧诱导的CFs纤维化反应。给予p53抑制剂或si-p53后,抑制TNAP的上述抗纤维化反应可被阻断。结论:抑制TNAP可能经p53信号通路发挥抗心脏纤维化作用。