研究目的：
　　利用多肽六聚组氨酸(His6)与锌离子间的配位作用，实现在温和条件下合成包封有肿瘤相关抗原(抗原肽GP100或mGP100)和佐剂CpG的亚单位疫苗。使所得亚单位疫苗具有较高的抗原和佐剂包封效率并保持其生物活性，并实现抗原肽及佐剂的高效胞内递送和快速的溶酶体逃逸。揭示该亚单位疫苗的理化性质及生物相容性，简要评价亚单位疫苗的免疫刺激效应，开发增强其免疫响应的亚单位疫苗，探讨在癌症免疫治疗新途径的可能性。
　　研究方法：
　　1、亚单位疫苗的制备及理化性能表征。在pH=9，超声条件下，将硝酸锌溶液滴加入His6或含有抗原肽(GP100或mGP100)及佐剂的溶液中，合成His6金属组装体（HmA）或HmA包裹的亚单位疫苗。运用动态光散射DLS，扫描电镜SEM，透射电镜TEM等技术手段系统表征上述亚单位疫苗制剂的粒径、分散性、电位、稳定性及颗粒形貌等理化特性。
　　2、抗原肽及CpG的包裹与释放。用琼脂糖凝胶电泳初步评估了HmA对佐剂的包封能力；通过紫外可见-近红光谱仪(UV-vis)精确测定了载体HmA对抗原肽(GP100或mGP100)和佐剂CpG的包封效率；在类细胞环境中(不同pH条件)观察抗原肽及CpG的与释放行为。
　　3、亚单位疫苗的细胞毒性评价及免疫刺激评价。利用CCK-8试剂盒检测修饰PEG或者未修饰PEG的纳米疫苗制剂对抗原提呈细胞DC2.4及RAW264.7的体外生物安全性。通过激光扫描共聚焦显微镜LSCM和流式细胞仪FCM定性定量评估了细胞对纳米疫苗制剂的吞噬效率以及所包载药物的溶酶体逃逸情况。颗粒与细胞共孵育后，应用多种技术手段(流式细胞术FCM，ELISA试剂盒，总RNA抽提试剂盒，PCR等)检测共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达、细胞因子(TNF-α)的分泌水平以及细胞因子(TNF-α，IL-6和iNOX)的mRNA表达水平，评估亚单位疫苗的免疫刺激效应。
　　4、免疫响应增强型的亚单位疫苗。将His6接枝到八臂PEG上，并用其制备亚单位疫苗。利用PEG的水溶性特点，增强亚单位疫苗的稳定性和分散性。利用上述方法，系统地研究经此改进后的亚单位疫苗的理化性质、抗原肽及CpG的包裹与释放，及免疫刺激评价。
　　研究结果：
　　1、亚单位疫苗被成功制备，其具有较好的分散性及纳米级尺寸，表面电荷呈正电性。在亚单位疫苗制备的过程中，抗原肽及CpG可被高效地包裹（包裹率高达90%以上）。包裹的抗原肽及CpG表现出pH依赖的释放行为：pH越低释放越快。
　　2、亚单位疫苗具有较低的细胞毒性，且能够高效被免疫细胞内吞，其包裹的抗原肽及CpG能够快速在溶酶体中释放。亚单位疫苗制剂(GP100+CpG)@HmA及(mGP100+CpG)@HmA-PEG上调了共刺激分子以及促炎性细胞因子的表达，组间存在显著性差异。
　　3、改进亚单位疫苗的稳定性和分散性可显著提高亚单位疫苗的免疫性能。
　　研究结论：
　　利用多肽六聚组氨酸（His6）与锌离子间的配位作用，可实现在温和条件下合成包封有肿瘤相关抗原(抗原肽GP100或mGP100)和佐剂CpG的亚单位疫苗。这种制备方式具有较高的抗原和佐剂包封效率。此外，该疫苗制剂具有窄分散的正电性纳米级尺寸，pH响应性缓释等特点。该疫苗制剂具有高效胞内递送和快速的溶酶体逃逸。并能显著提高免疫刺激效应显著提高共刺激分子的表达、细胞因子的分泌以及细胞因子的mRNA表达水平，引发强有力的免疫应答，并且有可能为癌症免疫治疗开辟新途径。