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结核病仍对人类健康构成重要威胁。全球现有TB患者近3000万，每年病死数近300万。结核病唯一可用的免疫预防制剂是BCG。它的免疫保护力介于0-80％之间，WHO的调查研究表明其保护力也仅为50％。成年人及老年人并不能得到BCG的有效保护。BCG对热敏感，在运输、贮存中需要低温保存。因此寻找新型高效，效果稳定的疫苗一直是相关领域研究人员关注的热点。 本研究的目的，是设计和构建真核表达结核菌蛋白的载体即DNA疫苗，并对其免疫功能及保护力进行研究。所设计构建的10种结核DNA疫苗依次为TB-V1，表达结核菌Mtb8.4；TB-V2，表达结核菌Ag85B蛋白；TB-V3，表达Mtb8.4、38kDa的Th表位和CTL表位以及Ag85B的融合蛋白；TB-V4，表达GST和Mtb8.4的融合蛋白；TB-V5，表达GST与Ag85B的融合蛋白；TB-V6，表达含hIL-2信号肽的Mtb8.4；TB-V7，表达含信号肽的Ag85B；TB-V8，表达含信号肽的Mtb8.4、38kDa蛋白的CTL／Th表位以及Ag85B成熟蛋白的融合蛋白；TB-V9，表达信号肽的Mtb8.4与GST的融合蛋白；TB-V10，表达含信号肽的Ag85B与GST的融合蛋白。TB-V6-TB-V10等5种载体，均在表达结核蛋白的N末端插入hIL-2的信号肽。p-hIL2质粒表达hIL-2；p-hIL2s质粒仅表达hIL-2的信号肽，作为对照。 所构建的12种质粒DNA，经PCR、酶谱鉴定后，并对插入表达目的的DNA片段进行了测序分析，表明所构建的12种载体质粒与构建设计准确无误。 p-hIL2、p-IL2s、TB-V6、TB-V7、TB-V8、TB-V9与TB-V10质粒DNA，以0.1M PBS将其分别稀释成1mg／mL溶液，除菌，然后分别在0d、15d和30d，分3次在8-10周龄的雌性C57BL／6小鼠四肢肌肉各注射0.1mL(100 μg／只小鼠)。对照组为等剂量的pVAX1、D-IL2s、PBS溶液。阳性对照组为BCG，以10~5CFU注射小鼠皮内，与其他小鼠初免时一同免疫，该组每只小鼠只免疫1次。疫苗免疫组、对照组共12组，分别是TB-V6～TB-V10等5组，p-IL2质粒注射组，TB-V6+p-hIL22作者:华南热带农业大学博士研究生朱中元，导师:张春发和TB一7+，hILZ联合免疫2组(每种质粒各50 ug免疫)，PBs，BcG，pVAXI和尸LZs共4个对照组。每组10只小鼠。 在最后一次DNA疫苗加强免疫15天后，杀死每组的其中5只小鼠，取脾磨成匀浆，并用10%FCS RPMll64O培养基将脾淋巴细胞配成10VmL浓度，加入到24孔培养板中，200 pl吼，5%Cq条件下培养72h，上清经ELIsA法测定鼠白细胞介素一(mIL一2)、而L-6、而L一10和鼠7干扰素(mIFN斗)。处死小鼠时采血，用于测定hIL一2。 在DNA疫苗最后一次加强免疫的21天，将结核菌H37RLv株培养约20天的细菌磨成悬液，取106/0.llnL菌经尾静脉注射实验感染每组剩下的5只小鼠。感染15天后，杀死所有小鼠，取脾、肝和肺分别称重，制成匀浆，接种0.lmL于改良罗氏培养基(L一)培养瓶，置37C培养20一30天，计数。并根据器官重量和稀释倍数，换算出每种器官培养物的CFUlg。每个小鼠的每种器官各接种3支L一培养，取其均数作为最后结果。 检测各免疫组、对照组的上清中的而L一2，而L一6，而L一10和而FN斗以及血清中hIL一2的含量，显示TB一v6，TB一V7，TB一vs，TB一vg，TB一V10，TB一v6+P扣L2，TB一v7+p扣L2及p一hILZ等8个免疫组的mIFN斗及mIL一显著高于pVAXI，PBs和p一LZs质粒对照组，与BCG免疫组的水平稍低或相当。其中p.hiLZ注射组，TB一v6+p-hiLZ以及犯一7+p一址LZ联合免疫组小鼠血清hIL一2水平显著升高。而这8组的体外淋巴细胞培养上清中的nilL一6及mIL一10的含量不升高或升高不明显。表明犯J6~TB一vlo等5种DNA疫苗及p扣LZ表达载体能够刺激预防结核病所需的几1型免疫应答。 TB一6~TB一V10等5种疫苗免疫的5只小鼠的脾结核菌载量分别为44 1 68、28400、1 8597、34703和22954CFIJ/g。TB一v6+P一LZ和TB一V7+P一L2联合免疫组和p一hILZ注射组的脾结核菌载量分别为12471、34x57和51339 CFU/g。对照组邓S、pVAXI、p一LZs及BCG的脾细胞悬液的结核菌计数结果均数分别是:61012、60716、69395和1 1 164CFU/g。表明本研究中构建的，IB一6~TB一v10等疫苗具有减少免疫鼠经H37Rv攻击后脾脏结核菌载量，且TB一vs疫苗，TB一v6+P一砚联合免疫，产生的保护力与BCG免疫产生的保护力非常接近。为进一步研究这些疫苗防止大动物感染结核菌H37Rv的实验研究奠定了基础。 我们在结核DNA疫苗的构建设计中使用了hIL一2信号肤序列，并采用表达hIL.2的质粒与TB DNA疫苗联合免疫及构建表达融合蛋白(GST)的疫苗，并获得与BCG非常接近的保护力。均为TB DNA疫结核D队疫苗的构建、免疫功能及保护效果研究」苗研究首次报道。取得了预期的研究结果，对其他疫苗的研究有指导参考价值。 结论:1.所构建的表达结核菌蛋白或融合蛋白的载体:邓一1、TB一2、TB~V3、TB.V4、TB~VS、TB一V6、TB~V7、TB一VS、TB一Vg、TB一V10、表达bIL.2的载体卜拍LZ和表达hiL一2信号肤的载体尸LZs等经抗性筛选、酶谱鉴定及DNA序列分析，结果表明12种DNA疫苗表达载体质粒的构建均与设计要求准确无误。2.TB一6、TB一V7、TB一7、TB一VS、TB一Vg与TB一V105种DNA疫苗单独免疫，或者