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研究目的:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是中老年人群中主要的致盲性眼病之一。渗出型AMD的主要特征为病理性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成,其形成也是导致AMD患者不可逆性视力损害的主要原因。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在多种眼部增生性疾病的发生和发展过程中起重要的调节作用。本研究旨在探讨lnc RNA-IPW在CNV中的调控作用,为CNV的治疗提供新思路。研究方法:1.通过qRT-PCR验证lnc RNA-IPW在低氧胁迫细胞模型及CNV动物模型中的表达规律。2.体外实验选用脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6As),利用RNA干扰技术(RNA inference,RNAi)及pc DNA3.0质粒过表达系统下调或上调RF/6A细胞内lnc RNA-IPW的表达。通过MTT、PI/Calcein-AM染色、Ed U染色、Transwell实验检测lnc RNA-IPW表达量的改变对RF/6A细胞的活力、增殖、迁移、成管能力和细胞凋亡的影响。3.体外培养视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体,利用玻璃体腔注射sh RNA慢病毒载体下调或上调小鼠脉络膜组织中lnc RNA-IPW的表达量,取小鼠视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜组织行内皮细胞出芽实验,检测lnc RNA-IPW表达量的改变对脉络膜细胞新生血管形成能力的影响。4.体内实验构建激光诱导的CNV小鼠模型,利用sh RNA慢病毒载体下调或上调在CNV小鼠模型脉络膜组织中lnc RNA-IPW的表达量。通过脉络膜平铺片IB4染色、视网膜-脉络膜-巩膜组织石蜡切片HE染色明确lnc RNA-IPW在CNV中的调控作用。5.分子机制研究通过RNA荧光原位杂交技术(RNA fluorescence in situ hybridization,RNA FISH)明确lnc RNA-IPW在细胞中的定位,利用双荧光素酶检测技术与RNA pull-down实验验证lnc RNA-IPW与mi R-370的结合。体外实验利用mi R-370 mimic转染RF/6A细胞,通过MTT、PI/Calcein-AM染色、Ed U染色、Transwell实验、脉络膜出芽实验检测lnc RNA-IPW/mi R-370表达量的改变对RF/6A细胞的活力、增殖、迁移、成管能力和细胞凋亡的影响及对脉络膜细胞新生血管形成能力的影响。体内实验通过构建mi R-370模拟物(agomir)干预激光诱导的CNV小鼠模型,采用脉络膜平铺片IB4染色、组织切片HE染色,研究lnc RNA-IPW/mi R-370表达量的改变在CNV中的调控作用。通过双荧光素酶检测分析mi R-370对KDR和BMP的靶向作用。研究结果:1.qRT-PCR发现,在低氧胁迫细胞模型及激光诱导的CNV小鼠模型的视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜组织中lnc RNA-IPW的表达显著上调。2.体外实验结果显示,沉默lncRNA-IPW在RF/6A细胞中的表达可抑制其细胞活力、增殖、迁移和成管能力,促进细胞凋亡;过表达lnc RNA-IPW可增强RF/6A细胞的细胞活力、增殖、迁移和成管能力,抑制细胞凋亡。3.在体外视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜外植体培养实验中,敲低lncRNAIPW在小鼠脉络膜组织中的表达可抑制外植体的出芽能力;过表达lnc RNA-IPW可增强外植体的出芽能力。4.体内实验在CNV小鼠模型中,敲低lncRNA-IPW在小鼠脉络膜组织中的表达后,脉络膜平铺片IB4染色实验示CNV的面积减小,组织切片HE染色实验示CNV病灶厚度与面积减小,与贝伐单抗玻璃体腔注射治疗的效果相当,且与贝伐单抗联用对CNV的抑制作用更明显;过表达lnc RNA-IPW后,脉络膜平铺片IB4染色实验示CNV的面积增大,组织切片HE染色实验示CNV病灶厚度与面积增大。5.分子机制研究中,RNA FISH实验、双荧光素酶检测与RNA pull-down实验证实lnc RNA-IPW与mi R-370共定位于RF/6A细胞的细胞质中并可互相结合。体外实验中,mi R-370 mimic转染可增强RF/6A细胞的活力、增殖、迁移和成管能力,抑制细胞凋亡,mi R-370 mimic与lnc RNA-IPW si RNA共转染可抑制lnc RNA-IPW沉默对细胞功能的影响。体内试验中,mi R-370 agomir干预后,脉络膜平铺片IB4染色实验示CNV的面积增大,组织切片HE染色实验示CNV病灶厚度与面积增大,抵消了敲低lnc RNA-IPW对CNV的抑制作用。双荧光素酶检测证实Lnc RNA-IPW可通过吸附mi R-370发挥竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA)作用调控KDR和BMP的表达。研究结论:本研究在细胞及动物水平证实lncRNA-IPW对内皮细胞功能及CNV发生发展的影响,为研究CNV进展提供了新思路。lnc RNA-IPW有望成为治疗CNV及其他眼部新生血管性疾病的新靶点。