多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一类革兰阴性兼性厌氧条件致病菌,根据其荚膜抗原的不同可分为A、B、D、E和F共五种血清型,其中牛源A型多杀性巴氏杆菌作为牛呼吸道正常栖息菌,在应激条件下引起的牛呼吸道疾病综合征可给养牛业造成巨大的经济损失。当前已报道多种毒力因子在多杀性巴氏杆菌的致病过程中发挥着重要的作用。细菌溶血素是细菌分泌的一类外毒素,是细菌重要的毒力因子之一。本实验室前期研究发现,多杀性巴氏杆菌在有氧条件下培养不具有溶血特性,而在厌氧条件下培养具有溶血特性,但其溶血素基因、溶血机制以及能否作为毒力因子目前还不清楚。因此本研究首先验证多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下的溶血特性,在此基础上利用TMT及Label free蛋白组学技术结合生物信息学分析其溶血表型下的蛋白表达情况,然后从中筛选可能的假定溶血候选因子,最后将筛选的假定溶血因子进行原核表达并分析其溶血活性,主要研究方法及结果如下:1.多杀性巴氏杆菌的溶血特性分析首先,将牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2株划线涂布于马丁兔血平板,并将其置于有氧及厌氧条件同时培养3-5 d以及先有氧培养12 h后,转移至厌氧继续培养3-5 d,验证其是否存在溶血特性;同理验证其他牛源A型(Pm CQ1~Pm CQ7)、B和F型多杀性巴氏杆菌在马丁兔血及鸡血平板、LB兔血及鸡血平板上的溶血特性。结果显示,牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌在厌氧条件下(先有氧培养也可)培养3-5 d可出现溶血特性,而在有氧条件下不具有溶血特性。2.基于PmCQ2溶血表型的TMT蛋白组学分析及假定溶血因子的筛选应用TMT蛋白组学技术分析PmCQ2在溶血表型出现的中后期(厌氧条件,取样时间点为65 h)相对于对照组(有氧条件,取样时间点为12 h)其蛋白的表达情况,结合生物信息学分析差异表达蛋白的功能,从蛋白注释、差异表达倍数、蛋白结构域、亚细胞定位和基因家族主要功能着手去筛选潜在的溶血因子;同时用qRT-PCR及WB方法分别从mRNA水平及蛋白水平去验证蛋白组的结果。结果显示,(1)共鉴定到1639个蛋白,其中1603个蛋白可定量(定量蛋白表示至少一个比较组有定量信息),以1.2倍为差异表达阈值(ratio>1.2或ratio<0.83,且P<0.05),其中164个蛋白表达上调,282个蛋白表达下调。(2)GO功能注释显示,差异蛋白主要参与了代谢进程、细胞进程和单个有机体进程等8种生物进程;细胞和膜等4种细胞组分;催化活性和结合活性等6种分子功能。(3)COG功能注释显示,差异蛋白主要参与了能量的产生于转化、碳水化合物运输和代谢、翻译及核糖体结构和生物合成、细胞壁/膜的生物合成等共21个条目功能。(4)差异蛋白主要富集于核糖体、肽聚糖生物合成、脂肪酸代谢和生物合成通路、丁酸酯代谢、氧化磷酸化、柠檬酸循环(TCA循环)和丙酮酸代谢等KEGG通路。(5)差异蛋白在m RNA水平及蛋白水平的验证结果与蛋白组测定结果基本一致,表明蛋白质组学测定结果可靠。(6)基于蛋白注释、差异表达倍数、蛋白结构域、亚细胞定位和基因家族主要功能等筛选方法一共筛选到12个假定溶血候选因子(Pm1384、Pm0040、Pm2119、Pm0696、Pm2109、Pm2214、Pm806、Pm509、Pm1169、Pm769、Pm1333和Pm1211)。TMT蛋白组学分析结果表明多杀性巴氏杆菌在溶血表型出现的中后期可能通过抑制核糖体的合成来调控相关蛋白的表达,进而使肽聚糖、脂肪酸的合成与代谢受到抑制以减弱细菌的物质能量活动;同时促进错配修复、丙酮酸代谢、氧化磷酸化等通路代谢相关酶的表达以维持细菌的正常代谢活动,最终使其生长代谢受到明显的抑制。3.基于PmCQ2溶血表型的Label free蛋白组学分析及假定溶血因子的筛选由于TMT技术只能测到相对差异表达蛋白,因而再次应用无标记定量蛋白组学(Label free)技术分析PmCQ2在溶血表型出现的早期相对于对照组(取样时间点均为12 h)其蛋白的表达情况,结合生物信息学分析差异表达蛋白的功能,从蛋白注释、亚细胞定位和基因家族主要功能等分析厌氧条件下的绝对差异表达蛋白(仅在厌氧条件下表达),并从中筛选假定溶血候选因子。结果显示,(1)共鉴定到1612个蛋白,其中1399个可定量。以1.5倍为差异表达阈值(ratio>1.5或ratio<0.5,且P<0.05),39个蛋白表达上调,16个蛋白表达下调。(2)GO功能注释显示,差异蛋白主要参与了细胞代谢、有机物代谢和氮化合物代谢等11种生物进程;胞内、细胞周边和质膜等12种细胞组分;跨膜转运和铁结合活性等14种分子功能。(3)在COG功能分类中,差异蛋白主要分布于能量的产生与转化、碳水化合物运输和代谢、无机离子运输与代谢等12个条目中。(4)差异蛋白在KEGG中主要富集于丁酸酯代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸盐循环(TCA循环)、碳固定、脂肪酸降解和氧化磷酸化等通路。(5)经过蛋白注释、基因家族功能及亚细胞定位等分析绝对差异表达蛋白,选取Pm1196、Pm1271、Pm2075、Pm0440、Pm0774和Pm1154等6个蛋白作为假定溶血候选因子。Label free蛋白组学分析结果表明,多杀性巴氏杆菌在溶血表型出现的早期,其生长代谢仍然受到了轻微的抑制,总的来说合成ATP相关的蛋白通路酶基本上调,而与能量消耗相关酶则明显下调,这与TMT技术的结果基本一致。4.假定溶血因子的溶血活性分析及潜在抗原的免疫保护性研究对筛选的18个假定候选溶血因子进行原核表达、纯化及对包涵体蛋白进行复性,以0.05%的吐温20作为阳性对照,用打孔法测定溶血因子重组蛋白(浓度在2-3 mg/m L)在厌氧、有氧及5%CO2条件下的溶血活性;选取rPm1333、rPm1211、rPm806、rPm509、rPm0040和rPm2214免疫小鼠,每只小鼠每次免疫100μg,二免后第14天,采用断尾采血的方式采集各免疫组中5只小鼠的血液,分离血清,测定抗体效价,并以3.5×106 CFU(2LD50)肌肉攻毒探究其保护效果。结果显示,成功表达12个假定溶血因子,经溶血试验分析这12个假定溶血因子重组蛋白均无溶血活性。抗体测定结果显示rPm1333、rPm1211、rPm806、rPm509、rPm0040和rPm2214产生的抗体滴度在1:6400~1:404800之间,表明其具有良好的免疫原性,其中rPm1333、rPm1211和rPm806针对Pm的感染对小鼠分别有20%、10%、10%的保护性。