【摘 要】
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猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性肠道传染性疾病,对各个年龄阶段的猪均具有易感性。自2010年,变异PEDV在我国乃至全世界暴发,造成7日龄以内的哺乳仔猪感染后死亡率高达100%,严重损害了养猪业健康发展。PEDV为单股正链RNA病毒,主要编码4种结构蛋白和16种非结构蛋白。PEDV N蛋白是病毒感染早期合成最多的结构蛋白,在病
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猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性肠道传染性疾病,对各个年龄阶段的猪均具有易感性。自2010年,变异PEDV在我国乃至全世界暴发,造成7日龄以内的哺乳仔猪感染后死亡率高达100%,严重损害了养猪业健康发展。PEDV为单股正链RNA病毒,主要编码4种结构蛋白和16种非结构蛋白。PEDV N蛋白是病毒感染早期合成最多的结构蛋白,在病毒复制、转录和组装中发挥重要作用。TARDBP（TAR DNA binding protein）是一种RNA结合蛋白,具有转录、m RNA前剪接、m RNA转运和稳定性等多种功能。本实验室前期通过质谱分析筛选出与PEDV N蛋白互作的宿主因子TARDBP,为了探究TARDBP对PEDV增殖的影响及其作用机制,本研究展开了以下试验:为了检测PEDV病毒RNA,本研究通过构建PEDV N基因的阳性标准质粒,建立了一种基于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明:该检测方法线性关系良好,R~2值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23拷贝/μL;重复性好,组内变异系数在0.25%-0.43%之间,组间变异系数在0.67%-0.97%之间;对于不同地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究成功建立了PEDV实时荧光定量PCR检测方法,为开展PEDV的RNA临床样本检测和基础研究的检测试验奠定了基础。本研究预试验发现:TARDBP可以与PEDV N蛋白相互作用,抑制PEDV的增殖。为了探究TARDBP抑制PEDV增殖的分子机制,本研究从分析PEDV对TARDBP的调控作用以及TARDBP对PEDV增殖的抑制作用两个方面,进行深入研究发现:PEDV感染LLC-PK1细胞后,能够下调TARDBP的表达。为了解释这一现象,本研究扩增猪源TARDBP的启动子序列,分析其转录因子结合位点,经荧光定量PCR、si RNA及Ch IP等试验:证实PEDV感染宿主细胞,下调转录因子KLF16表达,进而抑制TARDBP的表达。TARDBP与PEDV N蛋白相互作用,并以剂量依赖性的方式降解PEDV N蛋白。为了探究TARDBP降解PEDV N蛋白的机制,经激活剂与抑制剂阻断及si RNA干扰自噬通路相关蛋白,发现TARDBP利用E3泛素连接酶MARCHF8泛素化PEDV N蛋白,进而通过自噬-溶酶体途径和泛素化-蛋白酶体途径最终降解PEDV N蛋白,发挥其抑制PEDV增殖的作用。为了进一步探讨宿主细胞利用TARDBP抑制PEDV增殖的分子机制,本研究梯度过表达TARDBP后,双荧光素酶报告试验结果表明:TARDBP上调I型干扰素;进一步研究表明:TARDBP通过上调干扰素上游关键分子My D88的蛋白水平进而激活TRAF3的蛋白水平以及IRF3的磷酸化,从而上调I型干扰素,抑制PEDV的增殖。综上,本研究建立了PEDV实时荧光定量PCR检测方法,揭示了宿主因子TARDBP通过自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径降解PEDV N蛋白以及TARDBP促进先天免疫进而抑制PEDV增殖的分子机制,为PEDV的防控提供了新的研究思路。
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