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[目 的]屈光不正的定义为眼在不使用调节时,平行光线通过眼的屈光介质后,不能在视网膜上清晰成像,而在视网膜前或后方成像。它包括远视、近视及散光。屈光不正患病率迅速上升,对公众健康有着极大的影响。其中,高度近视常伴有其他严重并发症,三分之一的高度近视患者会出现不可逆的视力障碍或失明。屈光不正的遗传方式多样,遗传学研究有利于屈光不正的基因诊疗。本研究的主要目的在于拟对一个高度近视家系进行致病基因筛查,明确导致其高度近视的致病基因,并试图探索其突变致病的分子机制。[方 法]（1）收集一高度近视家系,经屈光检查、眼前段及眼底疾病的排外检查,诊断为遗传性高度近视,并绘制家系图。获得每一位受试者的知情同意后,收集患者及家属的临床资料和外周血并提取DNA;选取一核心家系的三位成员DNA进行全外显子组测序,筛选致病基因并进行Sanger验证和共分离分析;（2）结合既往文献报道,整理PRSS56既往突变位点,筛选一个导致近视（c.G88A（A30T））、一个导致远视（c.G926C（W309S））的突变位点,以及本高度近视家系筛选出的突变位点（c.C827T（A276V））,作为进行下一步功能验证对象;（3）对该基因结构域、突变位点的进化保守性、稳定性进行分析;使用Pymol软件对突变蛋白进行同源建模,分析突变位点对蛋白质结构的影响;（4）合成PRSS56全长,构建C端带有FLAG的PRSS56野生型载体,在野生型载体模板上进行定点突变,将野生型和突变型载体瞬时转染到HEK-293T细胞内;（5）将细胞分为5组,WT组:野生型组;c.C827T（A276V）组:本研究鉴定的高度近视突变组;c.G88A（A30T）组:另一近视组;c.G926C（W309S）组:高度远视组;NC组:仅加入转染试剂的空白对照组;（6）转染48h后收集细胞培养上清,用ELISA测定上清中PRSS56浓度,测定不同分组活性;（7）除NC外四组细胞进行Western印迹法检测FLAG和Calnexin的表达并进行比较;（8）除NC外各分组进行Flag与Calnexin免疫双荧光检测,用共聚焦显微镜观察各组间的细胞形态学变化,并进行比较;（9）各分组细胞提取RNA后进行转录组测序分析;（10）实验数据用GraphPad Prism 6软件进行分析,用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行比较,p<0.05被认为数值差异显著,具有统计学意义,所有实验均独立重复3次。[结 果]（1）纳入本研究的高度近视家系共有四代27名成员,其中有10名患者被诊断为高度近视（9名女性,1名男性）,所有家庭成员均未患有与高度近视无关的严重眼部疾病和全身疾病;（2）筛选出三个候选基因:PRSS56、COL18A1、HNF1A,验证发现PRSS56,c.C827T（A276V）与本研究家系7个高度近视患者实现家系基因共分离;（3）通过生信分析,可知PRSS56 c.C827T（A276V）这一突变刚好发生于PRSS56蛋白质的保守结构域,各物种该位点均呈现高度保守性,且该突变会破坏野生型蛋白结构稳定性,使蛋白质3D构象产生显著改变;（4）转染48小时后的各组细胞培养上清中PRSS56浓度:c.G88A（A30T）,c.C827T（A276V）和 c.G926C（W309S）显著增加（P<0.01）;结果还显示,c.G926C（W309S）与NC组相比显著减少（P<0.01）,而WT组与c.G88A（A30T）相比显著减少（P<0.05）;（5）各分组 PRSS56 活性:c.G88A（A30T）,c.C827T（A276V）活性变化轨迹大致相同,均在1h后逐渐下降;c.G926C（W309S）组活性值逐渐下降,1h达到最低后基本维持相同水平,并且活性水平与近视分组相比较低;（6）由Western-blot结果可知,Flag标记的PRSS56这一融合蛋白仅在膜级份结构上表达;c.G88A（A30T）,c.C827T（A276V）PRSS56融合蛋白高表达,分别与c.G926C（W309S）组,WT组相比具有显著差异（P<0.05）;（7）细胞转染48h后各分组免疫荧光染色细胞在共聚焦显微镜下无差异,Flag与Calnexin均定位于内质网;（8）转录组分析结果如下:差异基因数量:c.G926C vs c.G88A&c.C827T 为 1321 个,WT vs c.G926C 为 157 个,WT vs c.C827T为80个,WT vs c.G88A差异基因数量为49个,可见c.G926C vs c.G88A&c.C827T明显高于其余三组;WT vs c.C827T和WT vs c.G88A共有的基因中,上调的有3个,下调的有6个,其中ANKHD1与PRSS56有较强关联;各组聚焦到的调控通路如下:c.G926C vs c.G88A&c.C827T:微管细胞骨架组织;WT vs c.C827T:对钙离子的反应、前体代谢产物和能量的产生;WT vs c.G88A:细胞防御反应、翻译后蛋白质修饰;WT vs c.G926C:氧化磷酸化、线粒体组织。[结 论]（1）本研究招募的四代常染色体显性高度近视家系,他们表现出疾病的临床表型,如屈光度≤-6.0D,眼轴长度>26mm,部分家庭成员已伴发高度近视并发症,如白内障、视网膜脱落、豹纹样眼底改变等;本研究首次在一中国高度近视家系中鉴定出PRSS56基因新的错义突变:c.C827T（A276V）;该突变位点与高度近视具有极强关联性,与家系患者实现共分离;该突变是高度保守的氨基酸取代,且通过改变残基之间的连接方式引起蛋白质构象变化导致其结构不稳定;（2）细胞功能机制研究验证了 PRSS56是一种分泌蛋白,定位于内质网,且突变后不改变其亚细胞定位;导致近视的突变型转染细胞分泌的丝氨酸蛋白酶浓度比高度远视组和野生型高,符合PRSS56功能丧失导致眼球缩小,与近视相关的PRSS56突变可能以相反的方式起作用这一初步预测,从而为PRSS56调控眼轴增长提供新的见解;（3）转录组测序分析结果提示PRSS56突变导致高度近视的调控通路与微管细胞骨架组织等具有较强的关联,且可能与ANKHD1基因有相关性,有待我们下一步的验证。