梭梭木质素合成对盐和渗透胁迫的响应及HaLAC15和HaCOMT的功能鉴定

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干旱和土壤盐渍化是日益严重的全球性问题,也是限制农业生产的主要逆境胁迫之一。全球范围内的土壤污染也是当今人类面临的严重的问题之一,废水、废液以及废气的大量排放导致部分地区土壤中重金属铜、三氯苯酚以及酚酸类化感物质超标,对农业生产和人民健康造成严重威胁。木质素是植物细胞壁的重要组成成分,具有水分运输、机械支持和抵抗病菌侵袭等重要的生物学功能。木质素积累和相关生物合成基因的大量表达有助于植物适应多种生物和非生物胁迫。荒漠植物由于长期面临各种逆境胁迫,在漫长的进化过程中形成了自身独特的形态结构和特殊的抗逆机制,蕴含着丰富的抗逆基因资源。荒漠旱生植物梭梭(Haloxylon ammodendron)是荒漠地区特有的小乔木,具有较强的木质化能力,对盐碱、干旱、高温、低温和土壤贫瘠等非生物胁迫均具有超强的适应性。目前关于梭梭适应非生物逆境的生理和分子机制尚不明晰,特别是木质素积累与其抵御干旱、土壤盐渍化和土壤污染之间的关系未见报道。鉴于此,本研究首先以梭梭为研究材料,通过分析盐和渗透胁迫下其木质素含量以及相关生理指标的变化,明晰木质素在梭梭抵御非生物胁迫中的作用,完善梭梭适应逆境的生物学机制。在此基础之上,寻找与梭梭木质素合成和逆境响应相关的重要功能基因;以盐和渗透胁迫下显著上调的漆酶基因Ha LAC15和咖啡酸-O-甲基转移酶基因Ha COMT作为重点研究对象,克隆了两个基因的全长,分析了它们的表达模式并进行亚细胞定位;最后研究了过表达Ha LAC15对拟南芥盐胁迫、重金属铜、酚酸类物质和三氯苯酚(2,4,5-trichlorophenol,TCP)耐受性的影响以及Ha COMT对拟南芥(Arabidopsis thaliana)耐盐性的影响。研究结果可为提高作物非生物胁迫抗性提供新的基因资源,也可为污染土壤的植物修复提供新的研究思路。取得的主要研究结果如下:(1)渗透胁迫和盐胁迫均显著诱导了梭梭木质素合成途径相关基因的表达,增加了木质素单体含量,通过显著上调漆酶和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性以及过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的含量增强了木质素的合成,从而使得梭梭植株体内木质素的含量显著增加;木质素在梭梭木质部和厚壁组织的沉积加强了它们的机械强度,增强了径向的受力性,从而维持了水分从根系向地上部运输的连续性;木质素在细胞壁的沉积减少了同化枝细胞水分的散失。(2)克隆得到了全长1855 bp、ORF长为1695 bp的梭梭漆酶Ha LAC15基因和全长1467 bp、ORF长为1092 bp的梭梭咖啡酸-O-甲基转移酶Ha COMT基因,两个基因在盐和渗透胁迫下均大量表达;亚细胞定位发现,Ha LAC15位于胞外,具有信号肽结构,是分泌蛋白,Ha COMT定位于细胞质膜;克隆到长度为2259 bp的Ha LAC15基因启动子,包含多个启动子和增强子区域顺式作用元件,与植物激素、信号、防御和应激反应相关;分别构建了Ha LAC15和Ha COMT过表达载体。(3)过表达Ha LAC15降低了拟南芥植株叶片的失水速率,增加了叶片中脯氨酸和甜菜碱的积累,降低了叶片渗透势和质膜透性,从而维持了拟南芥的水分状况;过表达Ha LAC15减少了盐胁迫下拟南芥根系对Na+的吸收及转运,增强了叶片的抗氧化酶活性,减少了H2O2的积累,维持了根系活力;过表达Ha LAC15增加了Cu胁迫下拟南芥植株木质素和纤维素的积累,增加了根系细胞壁对Cu的固定,维持了根系活力以及Fe与Mg元素向地上部的运输,减少了Cu在植株地上部的积累;Ha LAC15属于分泌型漆酶,对芥子酸、丁香酸以及TCP具有一定的分解能力,具有修复污染土壤的潜力。(4)过表达Ha COMT促进了盐胁迫下拟南芥叶片当中褪黑素的合成,维持了叶绿素含量和植株的生长,增强了叶片的抗氧化酶活性,维持了根系活力,减少了根系对Na+的吸收和转运,增强了Na+在根系的区域化能力和根尖对Na+的外排;增加了叶片脯氨酸和甜菜碱积累从而降低了渗透势,维持了叶片含水量,提高了拟南芥植株的耐盐性。以上结果表明,木质素在梭梭适应盐和渗透胁迫中发挥着重要的作用;过表达Ha LAC15显著的提高了拟南芥对盐、重金属铜、酚酸类物质以及三氯苯酚的耐受性;过表达Ha COMT在拟南芥适应盐胁迫过程中也发挥着重要的作用。研究结果可为提高栽培作物的抗逆性提供新的研究思路和优异基因资源。
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